معلومة

البروتينات في الماء مقابل البروتينات في الكريستال

البروتينات في الماء مقابل البروتينات في الكريستال


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

لست على دراية كبيرة بالإجراء التجريبي لعلم البلورات بالأشعة السينية إلا أنه ينطوي على مادة حساسة للغاية تتمثل في إنتاج بلورات تحتوي على بروتينات ثم تحيد الأشعة من خلالها للحصول على نمط يخبرنا عن شكل البروتين.

لكنني أشعر بالفضول عندما تبلور بروتينًا يبقى عادةً في السائل الخلوي ، فهل يمر بأي تغييرات توافقية أو في الحجم. على سبيل المثال ، لا يوجد بعض الضغط الذي يمارسه الماء والذي من المحتمل أن يؤدي إلى تقليل البروتين مقارنة بما قد يكون تحت ضغط أقل. أو ماذا عن التأثيرات الكارهة للماء التي تلعب دورًا مهمًا في طي البروتين. بالطبع بمجرد أن يتم طي البروتين ، يتم ربطه من خلال تفاعلات أقوى من مقاومة الماء ، لذا فهو ليس بهذه الحساسية. ولكن لا يزال التغيير الكامل في البيئة المحيطة يعتبر تغييرًا كبيرًا ، أليس كذلك؟ فهل هناك أي تفسيرات نظرية أو تجريبية حول ما إذا كان البروتين يتغير في الحجم و / أو الشكل أثناء التبلور؟ نرحب بالإشارات إلى كل من العمل التجريبي والنظري. على الرغم من أنني أعتقد أن الأدلة التجريبية ستكون أكثر منطقية في هذه المسألة نظرًا لأن الإمكانات عادةً ما يتم تحسينها لحساب الهيكل البلوري ليكون الحد الأدنى من الطاقة ، لذلك لا يمكنني رؤية كيف يمكن للأعمال النظرية أن تساعد في فهم هذه المشكلة. أعتقد أن إحدى الطرق هي أخذ بنية البروتين الأصلية التي تحددها الأشعة السينية وتشغيلها من خلال الميكانيكا الجزيئية للمبتدئين AB حيث لا تعتمد الإمكانات على المعلمات التي تم الحصول عليها من الحالات الأصلية للبروتينات في قاعدة بيانات PDB. لا أعرف كيف سيكون الأمر نظريًا على الرغم من ذلك.


لا تشبه بلورات البروتين بلورات المواد الأكثر شيوعًا مثل الملح [كلوريد الصوديوم] أو الماس [الكربون فقط.] لا تشتمل هذه المواد على ذرات أخرى في هياكلها البلورية. على سبيل المثال ، تحتوي بلورة كلوريد الصوديوم على أيونات الصوديوم وأيونات الكلوريد. ستُظهر دراسة البلورات بالأشعة السينية لهذه المادة ، بعد المعالجة الرياضية ، قمم كثافة الإلكترون لنوعين ، يمكن تمييز كل منهما بسهولة من حيث الشدة على أنه إما أيون صوديوم أو أيون كلوريد. ستكون أي قمم أخرى لكثافة الإلكترون قليلة ومتباعدة ، بالإضافة إلى أنها يمكن تحديدها بوضوح على أنها متطفل.

نظرًا لأن معظم البروتينات تحتوي على مناطق محبة للماء على السطح الخارجي للهيكل ، فإن بلورات البروتينات تحتوي في الواقع على جزء كبير من جزيئات الماء داخل البلورة نفسها. تعتبر جزيئات الماء هذه جزءًا من البلورة لأنها تتفاعل مع تلك البقايا المحبة للماء على السطح الثالث للبروتين ، سواء عن طريق الترابط الهيدروجيني ، في بعض الحالات ، أو التفاعلات القطبية الأقل تحديدًا في حالات أخرى. هذا على الأقل أحد الأسباب التي تجعل الحصول على بلورة أي بروتين عشوائي ليس مسعى روتينيًا على الإطلاق. إن النسبة الكبيرة من الماء في هذه البلورات تجعلها هشة للغاية بمجرد تشكلها ، كما أنه ليس من المحتمل بالضرورة أن تتشكل في المقام الأول.

إذا ذهبت إلى الأدبيات الفنية لإلقاء نظرة على خرائط كثافة الإلكترون التي يتم اشتقاق خرائط الهيكل الأكثر شيوعًا منها ، فستتمكن بالفعل من تتبع جزيئات الماء المحيطة بجزيئات البروتين الفردية.

في الواقع ، في أيام تطور علم البلورات البروتيني ، كان تخصيص ذرات معينة صحيحة لذروات كثافة الإلكترون المختلفة مهمة غير تافهة بالتأكيد.

بشكل فعال ، على الرغم من كونها بلورية ، فإن البيئة المكروية التي يعاني منها البروتين داخل البلورة تشبه إلى حد كبير البيئة المائية. لن تختلف التفاعلات الكارهة للماء والتفاعلات المحبة للماء كثيرًا عن تلك الموجودة في المحلول.

أي أن الحالة البلورية التي تم تحقيقها ليست ، في الواقع ، "تغييرًا كاملاً للبيئة المحيطة" لاستخدام العبارة التي استخدمتها في رسالتك.


علم بلورات البروتين واكتشاف الأدوية

1 ما هي بلورات البروتين؟

بلورات البروتين (الشكل 22.3) ، مثل أي بلورة من المركبات العضوية أو غير العضوية ، هي عبارة عن مصفوفات ثلاثية الأبعاد منتظمة من جزيئات متطابقة أو مجمعات جزيئية (الشكل 22.4). اعتمادًا على تناظر هذا الترتيب (الموصوف من قبل مجموعة الفضاء) ، فإن جميع الجزيئات في البلورة لها عدد محدود من الاتجاهات الفريدة فيما يتعلق بالشبكة البلورية. يتراكم حيود جميع الجزيئات الفردية لإنتاج شدة قوية بما يكفي للقياس ، وبالتالي تعمل الشبكة البلورية كمضخم. يوجد شرح لبعض المصطلحات البلورية الشائعة في المربع 22.1.

الشكل 22.3. أمثلة على بلورات البروتين. من اليسار إلى اليمين: معقد مثبط β-secretase البشري farnesyl pyrophosphatase في مركب مع مجال حمض zoledronic abl kinase في مركب مع imatinib (بإذن من SW Cowan-Jacob، Novartis) مركب مثبط cdk2.

الشكل 22.4. تعبئة بلورية لمركب الثرومبين البشري. يتم عرض اثني عشر خلية مع طبقة واحدة من الجزيئات. من خلال النظر بعناية ، يمكن للمرء أن يرى أن الجزيئين في كل خلية وحدة يدوران 180 درجة فيما يتعلق ببعضهما البعض. تمتد بلورات البروتين المستخدمة في حيود الأشعة السينية إلى ثلاثة أبعاد وتتكون من طبقات عديدة من الجزيئات. تلائم الطبقة التالية من جزيئات الثرومبين الثقوب الموجودة في الطبقة الموضحة.

بعض المصطلحات البلورية الشائعة

مجموعة الفضاء: مجموعة عوامل التماثل التي تصف تناظر البلورة. نظرًا لأن الجزيئات البيولوجية نشطة بصريًا ، فإن بلوراتها تنتمي إلى واحدة من 65 مجموعة فضائية غير متناظرة.

وحدة الخلية: اللبنة الأساسية للبلور. يمكن إنشاء البلورة بأكملها من خلال ترجمات الوحدة المتكررة للخلية في ثلاثة أبعاد. تتميز خلية الوحدة بمحاورها أ ، ب ، ج ، والزوايا (α ، β ، γ) بينهما.

وحدة غير متماثلة: أصغر شكل يمكن من خلاله إنشاء خلية الوحدة بأكملها عن طريق تطبيق عوامل التماثل في المجموعة الفضائية. قد تحتوي الوحدة غير المتماثلة على نسخة واحدة أو أكثر من البروتين أو المركب قيد الدراسة. في حالة الجسيمات قليلة القسيمات ، قد تحتوي الوحدة غير المتماثلة على جسيم كامل واحد أو أكثر أو وحدة فرعية واحدة أو أكثر إذا تزامنت بعض محاور التماثل للجسيم مع بعض محاور التماثل في البلورة.

انعكاس: شعاع منعرج من الأشعة السينية ، يتميز بمؤشراته h ، k ، l ، وينتج عن الانعكاس من المستويات الشبكية التي تصنع اعتراضات a / h و b / k و c / l مع محاور خلية الوحدة. يحتوي كل انعكاس على معلومات عن الهيكل بأكمله. الانعكاسات التي تحدث عند زوايا تشتت عالية لها مؤشرات عالية وتحمل معلومات عالية الدقة (أي أنها تتوافق مع عينات دقيقة من الهيكل) ، بينما تلك التي يتم ملاحظتها بالقرب من اتجاه الحزمة الساقطة لها مؤشرات صغيرة وتحمل معلومات منخفضة الدقة (أي ، تتوافق مع أخذ عينات خشن للهيكل).

الدقة: يتوافق حد الاستبانة مع أعلى زاوية تشتت يمكن عندها قياس الانعكاسات (راجع المربع 22.2). يمكن حل الذرات الفردية بالكامل عندما تكون الدقة أفضل من 1.0 درجة.

يتمثل أحد الاختلافات الملحوظة بين بلورات الجزيئات الصغيرة وبلورات الجزيئات الكبيرة في محتوى المذيب الكبير جدًا لهذه الأخيرة. تحتوي بلورات البروتين عادةً على 30-80 بالمائة (حجم / حجم) مذيب (في الواقع ، محلول التبلور المائي) [45]. فقط جزء بسيط من سطح البروتين متورط في التلامس البلوري ، والباقي مذاب بالكامل ، كما هو الحال في المحلول. نتيجة لذلك ، تكون بلورات البروتين ناعمة وهشة للغاية. ولكن على الجانب الإيجابي ، يمكن أن تنتشر الروابط ذات الوزن الجزيئي المنخفض والعوامل المساعدة والركائز من السائل الأم المحيط إلى قنوات المذيبات في البلورة. إذا لم يكن موقع الربط الخاص بهم مسدودًا بملامسات بلورية ، فيمكن تشكيل المجمع فى الموقع. عادة ، يمكن أن تحدث تغييرات توافقية صغيرة داخل الشبكة البلورية دون إتلاف البلورة ، وفي بعض الأحيان يمكن أيضًا استيعاب التغييرات الهيكلية الكبيرة جدًا. لذلك ، غالبًا ما تكون بلورات الإنزيم نشطة كمحفزات.


الكيمياء الكهربائية للبروتينات

نظرًا لأن مجموعة α-amino ومجموعة α-carboxyl من الأحماض الأمينية يتم تحويلها إلى روابط ببتيدية في جزيء البروتين ، لا توجد سوى مجموعة α-amino واحدة (عند الطرف N) ومجموعة α-carboxyl واحدة (عند الطرف C) في جزيء بروتين معين. يتأثر الطابع الكهروكيميائي للبروتين قليلاً جداً بهاتين المجموعتين. ومع ذلك ، فإن مجموعات الأمونيوم العديدة ذات الشحنة الموجبة (―NH3 +) من الليسين والأرجينين ومجموعات الكربوكسيل سالبة الشحنة (―COO -) لحمض الأسبارتيك وحمض الجلوتاميك. في معظم البروتينات ، يختلف عدد المجموعات الموجبة والسالبة الشحنة من 10 إلى 20 لكل 100 حمض أميني.


حجم 2

نيل إف دبليو سوندرز. بوستجان كوبي ، في كتيب تشوير الخلايا (الطبعة الثانية) ، 2010

السمات الهيكلية والمتسلسلة ذات الصلة بخصوصية الببتيد

كشفت الهياكل البلورية للبروتين أن كينازات البروتين قد امتدت أخاديدًا لاستيعاب تسلسل ركيزة البروتين حول موقع الفسفرة المستهدف (الشكل 182.2). تتلامس المخلفات في تسلسل الركيزة مع بقايا الأحماض الأمينية في أخدود ربط ركيزة بروتين كيناز يسمى مخلفات تحديد الركيزة (SDRs) (الشكل 182.2) ، وبالتالي تحديد الركائز المفضلة لربطها بالكيناز [15 ، 15 أ]. يمكن تحديد موقع SDRs عن طريق محاذاة تسلسل بروتين الاستعلام مع نموذج ماركوف المخفي [16] للمجال التحفيزي للكيناز الذي تم الحصول عليه من قاعدة بيانات مثل Pfam [17] أو SMART [18]. يوضح الشكل 182.3 محاذاة PKA البشري و PKG باستخدام SMART HMM S_TKc وبرنامج HMMER hmmalign. يلخص الجدول 182.4 حقوق السحب الخاصة الرئيسية. تعمل الأشكال المحفوظة (بالخط العريض) ببساطة كمرساة في التسلسل المرجعي للمحاذاة (HMM) التي يمكن من خلالها حساب مواقع SDR في تسلسل الاستعلام.

الشكل 182.2. يظهر التمثيل السطحي لـ PKA الببتيد الركيزة المرتبط وموقع المخلفات المحددة للركيزة.

تظهر حقوق السحب الخاصة الرئيسية باللون الرمادي الداكن. تظهر الركيزة الببتيدية RRASIHD على شكل عصي سوداء. الشكل الذي تم إنشاؤه من هيكل PDB 1JBP.

الشكل 182.3. محاذاة المجالات التحفيزية من PKA (KAPCA_HUMAN) و PKG (KGP1A_HUMAN).

تمت محاذاة المجالات التحفيزية باستخدام hmmalign لبرنامج HMMER وملف التعريف HMM S_TKc (SMART وصول قاعدة بيانات SM00220). تظهر "أشكال المرساة" المستخدمة لتحديد موقع المخلفات المحددة للركيزة (SDRs) في المحاذاة بالخط العريض. تم وضع خط تحت حقوق السحب الخاصة. يشار إلى الهوية (*) والتشابه (: أو.) بين حقوق السحب الخاصة في PKA و PKG. تظهر منطقة "حلقة KE" بخط مائل. تشير الأرقام الموجودة أسفل المحاذاة إلى الموضع في الركيزة بالنسبة إلى موقع الفسفرة الذي يتفاعل مع حقوق السحب الخاصة المقابلة.

الجدول 182.4. الركيزة الرئيسية التي تحدد المخلفات في PKA و PKG

الموضع بالنسبة إلى p [ST]حقوق السحب الخاصة 1 بقايا في PKAبقايا في PKG
ف - 3جل + 1E128E445
جل +3F130W447
جل +4S131T448
ص 2القرد − 2Y205Y524
القرد −3E204E523
القرد −5T202T521
ص 1GXG +2G53G369
GXG + 3S54G370
ف + 1القرد −1L206V525
القرد −4ص 203P522
DFG +3F188F505
ف + 2AMK +10V81V398
AMK +11K82D399
AMK +12L83T400
ف + 3القرد −8L199F518
القرد −9T198T517

تسلسل المجالات التحفيزية في PKA و PKG متطابقة بنسبة 50 بالمائة ومتشابهة بنسبة 70 بالمائة. يُترجم هذا إلى حقوق السحب الخاصة الرئيسية من كل كيناز ، والتي تكون متطابقة في 9/16 مواضع ومتشابهة في 6/16 أخرى. حقوق السحب الخاصة التي تؤثر على مواضع الركيزة P 3 و P 2 ، حيث يفضل Arg و Lys بشدة ، تكون متطابقة لموضع P 2 ويتم حفظها لموضع P 3 (الشكل 182.2). تقوم بقايا الركيزة P − 3 و P 2 بإجراء المزيد من الاتصالات (روابط H ، والجسور الكهروستاتيكية ، واتصالات van der Waals) مع مجال الكيناز الحفزي أكثر من أي سلاسل جانبية أخرى للركيزة ، وبالتالي توفر الجزء الأكبر من التفاعلات المطلوبة للببتيد النوعية.

تكمن أهم الاختلافات في حقوق السحب الخاصة في تلك التي ترتبط بالوضعين P + 1 و P + 2 في الركيزة سباعي الببتيد. V525 في PKG يحل محل L206 في PKA. تقوم السلسلة الجانبية الفالين الأقصر بإجراء اتصالات أقل مع الركيزة ، مما يشير إلى تفضيل أضعف للمخلفات الكارهة للماء في موضع P + 1 في ركائز PKG ، مقارنةً بتلك الموجودة في PKA. يتأثر موضع P + 2 بمنطقة "حلقة KE" من كينازات بروتين سيرين-ثريونين ، الموجودة بين نموذج AMK وبقايا الغراء C- الطرفية لـ AMK (الشكل 182.2). في PKG و D399 و T400 يتم استبدالها بـ K82 و L83 في PKA. ومع ذلك ، فإن الخصوصية في موضع P + 2 واسعة إلى حد ما في معظم كينازات بروتين سيرين ثريونين ، كما أن العدد المحدود من ركائز PKG المعروفة يجعل من الصعب التأكد من تأثير هذه البدائل. قد يكون من المفيد مقارنة الركائز المعروفة لكل من PKA و PKG بالحالات التي يُعرف فيها أحدهما فقط أو الآخر بفوسفوريلات الركيزة. على سبيل المثال ، كل من PKA و PKG كلاهما فسفوريلات S660 و S700 و S737 و S813 في منظم توصيل غشاء التليف الكيسي عند تسلسل RRNسILT ، RKNسILN ، RRLسLVP و RRLسQET (موقع الفسفرة موضح بالخط العريض) [19] ، بينما تسلسل RTLسVSS في سينسيز الجليكوجين هو ركيزة لـ PKA ، ولكن ليس PKG [20]. يشير هذا إلى أنه ضمن تسلسلات معينة ، يمكن أن تلعب المواضع P + 2 و P + 3 دورًا مهمًا في تحديد خصوصية الببتيد التفاضلي في PKA و PKG. بدلاً من ذلك ، قد تفسر الاختلافات بين PKA و PKG في الجيب الذي يربط بقايا P 3 (Phe and Ser في PKA مقابل Trp و Thr في PKG الجدول 182.4) للتعرف التفاضلي على زوج Arg-Thr من البقايا عند P 3 و P − 2 في تركيب الجليكوجين.

تُستخدم حقوق السحب الخاصة بواسطة طريقة Predikin [15 ، 15 أ] للتنبؤ بمواقع الفسفرة للكيناز بالنظر إلى تسلسله فقط. يتم عرض مصفوفات الوزن Predikin لركائز PKA و PKG في المواضع P - 3 إلى P + 3 في الجدول 182.5. بشكل عام ، تتوافق المصفوفات جيدًا مع ركائز PKA / PKG المرصودة ، باستثناء أنه من المتوقع وجود تفضيل قوي للمخلفات الكارهة للماء (Phe و Val و Met بشكل خاص) في موضع P + 1. تم العثور على Ile و Leu و Val في P + 1 في حوالي 40 في المائة من heptapeptides الركيزة PKA المعروفة ، لكن Met و Phe غير شائعين. أحد أسباب ذلك هو أن المناطق المحيطة بموقع الفسفرة تحتاج إلى التعرض للمذيبات وربط الكيناز بتشكيل ممتد ، وبالتالي فإن وجود فائض من المخلفات الكارهة للماء سيكون غير مواتٍ [21].

الجدول 182.5. توقع Predikin مصفوفة الوزن في المواضع P 3 إلى P + 3 لركائز PKA و PKG بناءً على بقايا تحديد الركيزة

PKA (P17612)
أجدهFجيحأناكإلمنصسرستيالخامسدبليوص
ص − 30.92−1.89−3.21−3.89−2.89−3.47−2.47−0.161.84−2.43−1.89−2.89−0.420.212.47−3.891.300.24−0.89−2.47
ص −21.11−0.76−0.60−0.690.560.09−0.50−1.82−0.21−0.760.24−2.08−0.86−0.711.46−0.180.880.33−2.08−2.67
ص −1−0.37−0.75−0.91−0.951.100.86−0.70−3.780.43−0.830.800.22−0.37−0.910.400.860.29−1.84−0.530.87
P0−5.13−3.55−4.87−5.55−4.55−5.13−4.13−4.87−5.13−5.87−3.55−4.55−5.13−4.87−5.132.942.83−5.13−2.55−3.36
ف + 10.10−1.96−3.280.321.62−3.54−2.541.430.10−1.303.19−2.96−3.54−3.28−0.57−0.980.360.73−0.96−2.54
ف + 21.272.31−2.39−3.07−2.07−2.65−1.650.99−2.65−3.39−1.070.45−2.652.88−0.14−3.07−2.39−0.14−0.07−1.65
ف + 3−1.61−0.490.200.40−1.491.97−1.750.320.96−0.95−0.49−1.490.29−2.49−4.090.54−0.48−0.98−1.50−1.07
PKG (Q13976)
أجدهFجيحأناكإلمنصسرستيالخامسدبليوص
ص −3−0.90−1.88−3.20−3.88−2.88−3.46−2.46−0.641.86−2.42−1.88−2.88−0.400.232.49−3.881.320.26−0.88−2.46
ص −21.11−0.76−0.60−0.690.560.09−0.50−1.82−0.21−0.760.24−2.08−0.86−0.711.46−0.180.880.33−2.08−2.67
ص −1−2.01−2.471.28−0.720.580.460.32−3.790.130.072.04−0.62−0.68−0.66−0.15−0.06−0.42−0.921.380.85
P0−5.13−3.55−4.87−5.55−4.55−5.13−4.13−4.87−5.13−5.87−3.55−4.55−5.13−4.87−5.132.942.83−5.13−2.55−3.36
ف + 10.10−1.96−3.280.321.62−3.54−2.541.430.10−1.303.19−2.96−3.54−3.28−0.57−0.980.360.73−0.96−2.54
ف + 20.162.13−0.900.43−2.60−3.18−0.16−2.92−0.35−0.20−1.60−2.60−3.18−2.921.491.51−2.920.54−0.60−2.18
ف + 30.360.091.03−0.240.391.75−0.12−3.11−1.12−1.02−1.780.55−0.20−0.12−1.120.52−0.22−2.32−0.78−3.47

بالنظر إلى خصوصية الببتيد المماثلة لـ PKA و PKG ، فمن الواضح أن العوامل الأخرى مهمة في تحديد الركائز التي يفسفروها والمسارات التي تنظمها. بشكل جماعي ، يتم وصف هذه العوامل بمصطلح "التجنيد" ، والذي يشمل أي عملية تجمع بروتين كينيز وركائزه معًا في الخلية [22]. تشمل عمليات التوظيف (1) التعبير المشترك للكيناز والركيزة ، و (2) التوطين المشترك للكيناز والركيزة من خلال آليات بما في ذلك تفاعلات الإرساء أو السقالات.

الاستهداف الخلوي لـ PKA هو عملية جيدة التوصيف تتضمن بروتينات إرساء A-kinase (AKAPs) [23 ، 24]. ترتبط AKAPs بمجال إرساء عالي التقارب على الطرف N للوحدة الفرعية التنظيمية لـ PKA ، مما يشكل مجمعات يتم فيها توطين PKA مع ركائز تشارك في مسار تنشيط cAMP. هناك الآن أدلة متزايدة على توطين PKG في مجمعات السقالات دون الخلوية ("GKAPs") ، على الرغم من أنها أثبتت صعوبة تحديدها أكثر من AKAPs [25].


بروتينات كروية

البروتينات الكروية كروية الشكل وعادة ما تذوب في الماء. تشمل أمثلة البروتينات الكروية الهيموجلوبين والأنسولين والعديد من الإنزيمات في الجسم. تعود قابلية الذوبان المتزايدة للبروتينات إلى طي البروتين [1]. ينثني البروتين بطريقة تضع الأجزاء الكارهة للماء من السلسلة في الداخل والأجزاء المحبة للماء على السطح الخارجي للسلسلة. هذا يسمح للأقسام المحبة للماء بتكوين قوى بين الجزيئات مع جزيئات الماء التي تذوب البروتين. يحتوي الجزء المحب للماء من البروتين على أحماض أمينية ذات سلاسل جانبية قطبية. سيكون لهذه الشحنة شحنة معاكسة إما للهيدروجين أو الأكسجين في الماء ، مما يسمح بتكوين القوى بين البروتين والماء. العديد من جزيئات الماء سترتبط ببروتين واحد لأنها هياكل كبيرة مقارنة بالماء [2]. هيكل البروتين الكروي مستقر نسبيًا بسبب التفاعلات غير التساهمية مثل التفاعلات الكارهة للماء التي تثبت الهيكل في الهامش. هذه البروتينات حساسة جدًا لدرجة الحموضة ودرجة الحرارة وعوامل أخرى أيضًا [3].


الفرق بين البروتينات الكروية والبروتينات الليفية

يتحول نوع البروتينات الموجودة إلى حد كبير كروية وذات طبيعة كروية وقابلة للذوبان في الماء بسهولة ، تمييزًا للأنواع الأخرى ، إلى بروتينات كروية. هذا النوع من البروتينات موجود فقط في الحيوانات وله نوع يشبه العصا يمكن أن يبدو مثل سلك مجروح كرويًا ينقلب المبنى إلى بروتينات ليفية.

البروتينات الكروية مقابل البروتينات الليفية

البروتينات هي المركبات البيولوجية الأساسية التي يحتاجها جسم الإنسان بكميات كبيرة ، نظرًا لكتلتها الجزيئية الضخمة ، فهي تعتبر جزيئات كبيرة للوظائف المختلفة وإجراءات التوليف في جسم الإنسان. تتكون هذه البروتينات من واحد أو أكثر من سلاسل عديد الببتيد ، على الرغم من أن الوحدة الهيكلية الأساسية للبروتين هي حمض أميني. لتكوين البروتينات البيولوجية ، تتحد الأحماض الأمينية من خلال روابط الببتيد. كلمة بروتين مأخوذة من الكلمة اليونانية "protoso ، & # 8217 التي تعني" الأول. & # 8217 يظهر الاسم متطلباتهم في الجسم لوظائف مختلفة. إنها موجودة في بروتوبلازم الخلية ، وهي مسؤولة عن وظائف مختلفة بما في ذلك نقل المواد مثل الأكسجين والمعادن والمعادن وما إلى ذلك ، وعن الحركة الميكانيكية في جسم الإنسان. على أساس الهياكل ثلاثية الأبعاد ، الذوبان ، يتم تصنيفها على أنها بروتينات كروية وليفية. كلا البروتينين مهمان بنفس القدر للجسم. يُطلق على البروتين الذي له هيكل يشبه القضيب أو يشبه الخيط أو يشبه الصفيحة مع وجود جودة غير قابلة للذوبان في الماء البروتينات الليفية ، في حين يُسمى البروتين الذي يحتوي على تسلسل غير منتظم للأحماض الأمينية ونوعية الذوبان في الماء بروتين كروي.

يتحول نوع البروتينات الموجودة إلى حد كبير كروية وذات طبيعة كروية وقابلة للذوبان في الماء بسهولة ، تمييزًا للأنواع الأخرى ، إلى بروتينات كروية. صنف البروتينات موجود فقط في الحيوانات وله نوع يشبه العصا يمكن أن يبدو مثل سلك مجروح كرويًا ينقلب المبنى إلى بروتينات ليفية. العنوان المختلف تمامًا المستخدم لمثل هذه الأنواع من البروتينات يشمل البروتينات الكروية لأنها & # 8217 تحتوي على نوع كروي وهي في الأساس الأكثر وفرة إلى جانب البروتينات الليفية والغشائية والمضطربة. عنوان آخر يستخدم لمثل هذه الأنواع يشمل البروتينات الصلبة ويستخدم بشكل كبير كبروتين تخزين يتحول إلى مفيد في كل مرة توجد فيها ندرة مثل هذا الفيتامين طوال الجسم.

لا ينبغي أن تمتلك البروتينات الليفية خاصية الذوبان في الماء وبسبب هذه الحقيقة تبقى غير قابلة للذوبان. من ناحية أخرى ، البروتينات الكروية غير قابلة للذوبان في الماء وحتى الأحماض والقواعد. يظل محرك الجذب الموجود بين جزيئات البروتينات الليفية أقوى. من ناحية أخرى ، فإن قوة الجذب الموجودة بين البروتينات الكروية لها ارتباط هيدروجين ضعيف. يتكون النوع الرئيسي من البروتينات الليفية من الحرير والصوف والمسام والمسام والجلد. من ناحية أخرى ، فإن الأنماط الأولى من البروتينات الكروية تشمل البيض والحليب وغيرهما.

رسم بياني للمقارنة

أساسبروتينات كرويةالبروتينات الليفية
الذوبانالبروتينات الكروية قابلة للذوبان في الماء والأحماض والقواعد.تبقى البروتينات الليفية غير قابلة للذوبان في الماء والأحماض والقواعد.
الشكل والبعدتحتوي البروتينات الكروية على أشكال كروية شبيهة بالكرة ، وهي ثلاثية الأبعاد في الطبيعة.البروتينات الليفية لها هيكل يشبه القضيب أو الخيط أو يشبه الصفيحة.
القوى بين الجزيئاتضعيفقوي
وظيفةتؤدي البروتينات الكروية وظائف مختلفة بما في ذلك نقل الأكسجين في الدم ، واستقلاب الجلوكوز ، وتخزين الأكسجين في العضلات ، وتعمل كمحفز لمئات من التفاعلات التي تحدث داخل الجسم.تؤدي البروتينات الليفية عشرات الوظائف من توفير قوة الشد والصلابة والمرونة إلى توفير الوظائف الهيكلية مثل تكوين هياكل السقالات داخل الخلايا وهياكل الأغشية.
مثالمن أمثلة البروتينات الكروية الميوغلوبين والأنسولين والترانسفيرين والهيموغلوبين.من أمثلة البروتينات الليفية الكولاجين ، والديزمين ، والإيلاستين ، والأكتين.

ما هي البروتينات الكروية؟

البروتينات الكروية هي بروتينات قابلة للذوبان في الماء ولها تسلسل غير منتظم للأحماض الأمينية ولها أشكال كروية شبيهة بالكرة. هذه الأشكال ثلاثية الأبعاد في الطبيعة حيث يتم طي السلاسل متعددة الببتيد بطريقة لتشكيلها. نظرًا لأنها قابلة للذوبان في الماء ، يمكن نقلها إلى منطقة التأثير من خلال الذوبان في الدم وسوائل الجسم الأخرى. بصرف النظر عن كونها قابلة للذوبان في الماء ، فإنها تتمتع أيضًا بالجودة التي تجعلها قابلة للذوبان في الأحماض والقواعد. بالمقارنة مع البروتينات الليفية ، فهي هياكل أكثر تعقيدًا لأنها تتشكل مع سلاسل متعددة الببتيد تنثني وتشكل الشكل النهائي مثل الكرة. أحد أسباب ذوبانها في الماء والمكونات الأخرى هو ضعف قوتها بين الجزيئات. يؤدون وظائف مختلفة في جسم الإنسان بما في ذلك نقل الأكسجين في الدم ، واستقلاب الجلوكوز ، وتخزين الأكسجين في العضلات والعمل كمحفزات لمئات من التفاعلات التي تحدث داخل الجسم. بعض أفضل الأمثلة على البروتينات الكروية هي الميوغلوبين والأنسولين والترانسفيرين والهيموغلوبين.

ما هي البروتينات الليفية؟

البروتينات الليفية هي البروتينات التي تظل غير قابلة للذوبان في الماء والأحماض والقواعد ومركبات أخرى. بالمقارنة مع البروتينات الكروية ، لديهم قوى جذب أقوى بين الجزيئات. لذلك لا تتحلل أو تنقسم بسهولة. لديهم هيكل يشبه القضيب أو الخيط أو يشبه الصفيحة ، مما يجعلها أقل تعقيدًا فيما يتعلق بالشكل. كما يشير الاسم ، فإن معظم البروتينات الليفية مترابطة بطريقة تشكل هياكل ليفية. فهي لا تقل أهمية عن البروتينات الأخرى ، على الرغم من أن لديها المزيد من العمل للقيام به في وظيفة الدعم الميكانيكية للجسم. من توفير قوة الشد والصلابة والمرونة إلى توفير الوظائف الهيكلية مثل تكوين هياكل السقالات داخل الخلايا وهياكل الأغشية ، يتعين عليهم أداء عشرات المهام في جسم الإنسان. بعض من أفضل الأمثلة على البروتينات الليفية هي الكولاجين ، و desmin ، و elastin ، و F-actin.

الاختلافات الرئيسية

  1. البروتينات الكروية قابلة للذوبان في الماء والأحماض والقواعد ، بينما تبقى البروتينات الليفية غير قابلة للذوبان في الماء والمركبات الأخرى المذكورة أعلاه.
  2. تحتوي البروتينات الكروية على أشكال كروية شبيهة بالكرة ، وهي ثلاثية الأبعاد في الطبيعة حيث تتشكل من عدة طيات في سلاسل البولي ببتيد. من ناحية أخرى ، تحتوي البروتينات الليفية على هيكل يشبه القضيب أو يشبه الخيط أو يشبه الصفيحة.
  3. البروتينات الكروية لها ارتباط هيدروجين ضعيف بين الجزيئات بينما البروتينات الليفية لها قوة بين الجزيئات أقوى بين الجزيئات.
  4. تؤدي البروتينات الكروية وظائف مختلفة بما في ذلك نقل الأكسجين في الدم ، واستقلاب الجلوكوز ، وتخزين الأكسجين في العضلات ، وتعمل كمحفز لمئات من التفاعلات التي تحدث داخل الجسم. من ناحية أخرى ، تؤدي البروتينات الليفية عشرات الوظائف من توفير قوة الشد والصلابة والمرونة إلى توفير الوظائف الهيكلية مثل تكوين هياكل السقالات داخل الخلايا وهياكل الأغشية.
جانيت وايت

جانيت وايت كاتبة ومدوّنة في موقع Difference Wiki منذ عام 2015. وهي حاصلة على درجة الماجستير في العلوم والصحافة الطبية من جامعة بوسطن. بصرف النظر عن العمل ، فهي تستمتع بممارسة الرياضة والقراءة وقضاء الوقت مع أصدقائها وعائلتها. تواصل معها على تويترJanet__White


للطي حتى

في مسابقة التقييم النقدي للتنبؤ ببنية البروتين (CASP) التي تُجرى كل سنتين ، تتنافس المجموعات للتنبؤ بالبنية ثلاثية الأبعاد للبروتينات. هذا العام ، تفوق AlphaFold على جميع المجموعات الأخرى وقارن النتائج التجريبية على مقياس الدقة.

صعوبة التنبؤ ببنية البروتين

CASP14 (2020) منافسين آخرين

عندما تنافس DeepMind لأول مرة في عام 2018 ، اعتمدت خوارزمية تسمى AlphaFold على هذه الإستراتيجية المقارنة. لكن AlphaFold أدرج أيضًا نهجًا حسابيًا يسمى التعلم العميق ، حيث يتم تدريب البرنامج على مجموعة ضخمة من البيانات - في هذه الحالة ، تسلسلات وهياكل البروتينات المعروفة - ويتعلم تحديد الأنماط. فازت شركة DeepMind بسهولة ، حيث تغلبت على المنافسة بمتوسط ​​15٪ على كل هيكل ، وفازت بعشرات GDT التي تصل إلى حوالي 60 لأصعب الأهداف.

لكن التنبؤات كانت لا تزال خشنة للغاية بحيث لا يمكن أن تكون مفيدة ، كما يقول جون جامبر ، الذي يرأس تطوير AlphaFold في DeepMind. "كنا نعرف إلى أي مدى نحن بعيدون عن الصلة البيولوجية." للقيام بعمل أفضل ، قام جامبر وزملاؤه بدمج التعلم العميق مع "خوارزمية الانتباه" التي تحاكي الطريقة التي قد يقوم بها الشخص بتجميع أحجية الصور المقطوعة: أولاً ، قم بتوصيل القطع في مجموعات صغيرة - في هذه الحالة مجموعات من الأحماض الأمينية - ثم البحث عن طرق انضم إلى الكتل في كل أكبر. من خلال العمل مع شبكة كمبيوتر مبنية حول 128 معالجًا للتعلم الآلي ، قاموا بتدريب الخوارزمية على جميع هياكل البروتين المعروفة والتي يبلغ عددها 170000 أو نحو ذلك.

وقد نجحت. عبر البروتينات المستهدفة في CASP لهذا العام ، حقق AlphaFold متوسط ​​درجة GDT بلغ 92.4. بالنسبة إلى البروتينات الأكثر تحديًا ، سجل AlphaFold متوسط ​​87 ، 25 نقطة أعلى من أفضل التنبؤات التالية. حتى أنها برعت في حل هياكل البروتينات الموجودة في أغشية الخلايا ، والتي تعد أساسية للعديد من الأمراض البشرية ولكن يصعب حلها باستخدام علم البلورات بالأشعة السينية. يصف فينكي راماكريشنان ، عالم الأحياء التركيبية في مختبر مجلس البحوث الطبية للبيولوجيا الجزيئية ، النتيجة بأنها "تقدم مذهل في مشكلة طي البروتين".

يقول مولت إن جميع المجموعات المشاركة في مسابقة هذا العام قد تحسنت. ولكن مع برنامج AlphaFold ، يقول لوباس ، "لقد تغيرت اللعبة". حتى أن المنظمين قلقون من أن DeepMind ربما كان يغش بطريقة ما. لذلك وضع Lupas تحديًا خاصًا: بروتين غشائي من نوع من العتائق ، مجموعة قديمة من الميكروبات. لمدة 10 سنوات ، جرب فريقه البحثي كل حيلة في الكتاب للحصول على بنية بلورية للأشعة السينية للبروتين. "لم نتمكن من حلها."

لكن AlphaFold لم يكن لديه مشكلة. أعادت صورة مفصلة لبروتين من ثلاثة أجزاء وذراعان حلزونيان طويلان في المنتصف. مكّن هذا النموذج لوباس وزملائه من فهم بيانات الأشعة السينية الخاصة بهم في غضون نصف ساعة ، وكانوا قد تناسبوا نتائجهم التجريبية مع بنية AlphaFold المتوقعة. يقول لوباس: "إنه مثالي تقريبًا". "لا يمكن أن يكونوا قد خدعوا في هذا الأمر. أنا لا أعرف كيف يفعلون ذلك ".

كشرط للدخول في CASP ، وافق DeepMind - مثل كل المجموعات - على الكشف عن تفاصيل كافية حول أسلوبه للمجموعات الأخرى لإعادة إنشائه. سيكون ذلك بمثابة نعمة للخبراء التجريبيين ، الذين سيكونون قادرين على استخدام تنبؤات هيكلية دقيقة لفهم بيانات الأشعة السينية غير الشفافة وبيانات EM cryo-EM. يقول مولت إنه يمكن أيضًا أن يمكّن مصممي الأدوية من العمل بسرعة على بنية كل بروتين في مسببات الأمراض الجديدة والخطيرة مثل SARS-CoV-2 ، وهي خطوة رئيسية في البحث عن جزيئات لمنعها.

ومع ذلك ، فإن AlphaFold لا تفعل كل شيء بشكل جيد حتى الآن. في المسابقة ، تعثرت بشكل ملحوظ على بروتين واحد ، وهو مزيج من 52 مقطعًا صغيرًا متكررًا ، مما يؤدي إلى تشويه مواقف بعضها البعض أثناء تجميعها. يقول Jumper إن الفريق يريد الآن تدريب AlphaFold على حل مثل هذه الهياكل ، بالإضافة إلى تلك المجمعات من البروتينات التي تعمل معًا للقيام بالوظائف الرئيسية في الخلية.

على الرغم من سقوط تحدٍ كبير ، إلا أن تحديات أخرى ستظهر بلا شك. يقول ثورنتون: "هذه ليست نهاية شيء". "إنها بداية العديد من الأشياء الجديدة."


II. العناصر الأساسية لبنية البروتين

بالمعنى الحقيقي للغاية ، فإن بنية جزيئات الماء المرتبطة ببعضها البعض حول البروتين هي جزء من بنية البروتين: فهي تحدد شكل السلاسل الجانبية المكشوفة ، وتثبت أطراف الهياكل الثانوية ، وتحتل مواقع في المواقع النشطة حيث تؤثر الركيزة الملزمة وأحيانًا التحفيز. تعتبر خصائص الماء الكتلي حاسمة في تثبيت الشكل الأصلي المطوي للبروتينات (على سبيل المثال ، Kuntz and Kaufmann ، 1974) ، ولكن فقط الماء المرتبط هو الذي سنعتبره جزءًا فعليًا من ، وليس تأثيرًا عليه ، بنية البروتين.

تين. 58. رسم مجسم للعمود الفقري للروبريدوكسين بالحديد (الدائرة المملوءة) وروابط الكبريت السيستين وجميع جزيئات الماء (الدوائر المفتوحة) التي تم تحديدها أثناء صقل الهيكل بدقة 1.2 & Aring. مقتبس من رواية واتنبوغ وآخرون. (1979) ، الشكل 11 ، بإذن.

من المعتاد في بنى البروتينات عالية الدقة بالأشعة السينية أن يظهر عدد صغير من جزيئات المذيبات بشكل واضح إلى حد ما على شكل قمم في خريطة كثافة الإلكترون (انظر الشكل 13). الآن بعد أن تم تطبيق العديد من تقنيات التنقية على العديد من هياكل البروتين ، فإن تحديد مواضع الماء عادة ما يكون جزءًا من العملية. في حالات قليلة فقط ، مثل دراسة الروبريدوكسين في واتنبوغ وآخرون. (1978) ودراسة الأكتينيدين في بيكر (1980) ، تم إجراء محاولة حقيقية لتحديد جميع المياه المقيدة بإحكام إلى حد ما والقضاء على القمم الزائفة. يوضح الشكل 58 المياه حول الروبريدوكسين. يتم تحسين الوظائف والمواقف بحيث يمكن تحديد موقع المياه المطلوبة جزئيًا وكذلك المقيدة بإحكام. في الواقع ، لم يكن هناك سوى عدد قليل نسبيًا من المياه التي يقترب فيها الإشغال من 1 (23 من أصل 130 مياهًا تقع في روبريدوكسين بها إشغال & 0.9). [أصبح تحديد المياه وتنقيتها أمرًا قياسيًا تمامًا الآن ، وباستثناء الدقة المنخفضة ، يتم تخصيصها عادةً بأرقام بترتيب واحد لكل بقايا حمض أميني. لاحظ ، مع ذلك ، أنه لا يمكن حقًا فصل عوامل الإشغال والعوامل B بشكل نظيف للمياه في بعض الهياكل هذه الأيام فقط يتم تنقية المياه B ويتم ترك جميع المياه عند 1.0 إشغال ، ولكن هذا لا يعني بالطبع أنها موجودة دائمًا.]

هناك دراسة حديثة أخرى تقدم معلومات أقل مباشرة ، ولكنها أيضًا مفصلة للغاية ، حول الماء حول البروتين ، وهي حسابات مونت كارلو التي أجراها هاجلر ومولت (1978) لليبوزيم البيض. من مواضع البداية العشوائية ، يحصلون على سلسلة طويلة جدًا من المجموعات المحتملة لمواضع الماء التي يجب أن تخضع الخصائص الإحصائية لجميع قيود وظائف الطاقة المستخدمة. يمكن رسم خرائط الكنتور لإعطاء التردد الكلي لموقع الماء في كل نقطة ، وهي تتطابق مع خطوط كثافة إلكترون الأشعة السينية المكررة بشكل جيد. Also, individual sets of positions at single cycles in the simulation can be examined. The energies of water molecules in various types of locations can be determined for the overall simulation and can be compared with the energy distribution for the bulk water.

تين. 59. Water molecules (open circles) in prealbumin, bridging between main chain groups that are too far apart to continue &beta -type hydrogen-bonding between strands. A hydrogen bond to a tyrosine side chain is also shown.

The detailed study of water structure around proteins is only just beginning, but a number of conclusions can be drawn from the crystallographic and theoretical work that has already been done. Isolated water molecules occur trapped inside protein interiors, where they can fill defects in the side chain packing and usually make some hydrogen bonds to protein atoms. Their energies are rather high, but it is much better to have a water than an empty hole in those locations. The number of such internal waters varies very widely from one protein to another. Both for internal and for surface waters, it is very common that they bond to the first free backbone NH or CO groups at the ends of pieces of secondary structure for &beta strands it is common that the last H-bond opens up wider, with a water bridging in between (see Fig. 59).

تين. 60. A stereo view of one of the hydrogen-bonded networks of water molecules at the surface of the rubredoxin molecule [adapted from Watenpaugh وآخرون. (1978), Fig. 7, with permission]. The size of the waters is proportional to their occupancy factors, so that the most well-ordered waters are shown largest.

The most ordered surface waters are those around charged side chains or in surface crevices. Occasionally those crevices can be very deep, such as the active site pocket in carbonic anhydrase, which extends about 15 Å in from the surface, with a network of water molecules (Lindskog وآخرون., 1971). The well-ordered waters at the protein surface are usually part of an approximately tetrahedral (but sometimes planar trigonal) network of hydrogen bonds to the protein and to other waters. An example from rubredoxin is shown in Fig. 60.

Both crystallographically and also from vapor-pressure measurements of solvent stabilization (Wolfenden, 1978) it appears that water hydrogen bonds more frequently and more strongly to peptide CO groups than NH groups. In rubredoxin, only 24% of the available backbone NH groups are bonded to water and 70% to other protein atoms, while for the CO groups 43% bond to waters, 41% to protein atoms, and another 8% to both (Watenpaugh وآخرون., 1978).

Many of the tightly bound waters have energies substantially lower than the bulk water (Hagler and Moult, 1978). All studies have found that most of the bound waters, and all of the highly ordered ones, are in the first coordination layer, but that they do not by any means cover the whole protein surface. A substantial number of partially ordered waters are found in the second coordination layer (where they hydrogen-bond to the protein only through first-layer water) and essentially none any further out than that, even where there are suitably sized channels between neighboring protein molecules. The degree of motion seen for individual water molecules also increases dramatically as a function of their distance out from the protein. [Waters, and exposed side chains as well, are more ordered at the cryogenic temperatures now standardly used for data collection, and they are also more ordered in crystal contacts. The molecular contacts in a crystal are usually rather weak, with relatively sparse contact between protein atoms but many contacts through single ordered waters. Such contacts can even have hydrophobic atoms on both sides with rings or clusters of waters in between, as seen in the very high-resolution crambin structure (Teeter).]


Soaking protein crystals with ligands is the fastest route to produce high-throughput structures for fragment based drug discovery. mosquito can be used to prepare small soaking drops of DMSO based fragment libraries directly from stock plates.

By maintaining a cold environment and pre-chilling the sample holder block it is possible to use mosquito crystal to accurately and easily pipette the bicelle solution, thereby facilitating the automation of screening for this lipidic based technique of membrane protein crystallization.


Aquaporins: water channel proteins of the cell membrane

Aquaporins (AQP) are integral membrane proteins that serve as channels in the transfer of water, and in some cases, small solutes across the membrane. They are conserved in bacteria, plants, and animals. Structural analyses of the molecules have revealed the presence of a pore in the center of each aquaporin molecule. In mammalian cells, more than 10 isoforms (AQP0-AQP10) have been identified so far. They are differentially expressed in many types of cells and tissues in the body. AQP0 is abundant in the lens. AQP1 is found in the blood vessels, kidney proximal tubules, eye, and ear. AQP2 is expressed in the kidney collecting ducts, where it shuttles between the intracellular storage sites and the plasma membrane under the control of antidiuretic hormone (ADH). Mutations of AQP2 result in diabetes insipidus. AQP3 is present in the kidney collecting ducts, epidermis, urinary, respiratory, and digestive tracts. AQP3 in organs other than the kidney may be involved in the supply of water to them. AQP4 is present in the brain astrocytes, eye, ear, skeletal muscle, stomach parietal cells, and kidney collecting ducts. AQP5 is in the secretory cells such as salivary, lacrimal, and sweat glands. AQP5 is also expressed in the ear and eye. AQP6 is localized intracellular vesicles in the kidney collecting duct cells. AQP7 is expressed in the adipocytes, testis, and kidney. AQP8 is expressed in the kidney, testis, and liver. AQP9 is present in the liver and leukocytes. AQP10 is expressed in the intestine. The diverse and characteristic distribution of aquaporins in the body suggests their important and specific roles in each organ.


Haemoglobin is a water soluble globular protein which is composed of two α polypeptide chains, two β polypeptide chains and an inorganic prosthetic haem group. Its function is to carry oxygen around in the blood, and it is facilitated in doing so by the presence of the haem group which contains a ( ext^<2+>) ion, onto which the oxygen molecules can bind.

Collagen is a fibrous protein consisting of three polypeptide chains wound around each other. Each of the three chains is a coil itself. Hydrogen bonds form between these coils, which are around 1000 amino acids in length, which gives the structure strength. This is important given collagen’s role, as structural protein. This strength is increased by the fact that collagen molecules form further chains with other collagen molecules and form Covalent Cross Links with each other, which are staggered along the molecules to further increase stability. Collagen molecules wrapped around each other form Collagen Fibrils which themselves form Collagen Fibres.


شاهد الفيديو: طرق فصل وتنقية البروتينات (يوليو 2022).


تعليقات:

  1. Arakazahn

    أعتذر ، لكن في رأيي أنك مخطئ. أقدم لمناقشته. اكتب لي في رئيس الوزراء ، سنتحدث.

  2. Efren

    إنه لأمر مؤسف ، الآن لا أستطيع التعبير - إنه مضطر للمغادرة. لكنني سأطلق سراحي - سأكتب بالضرورة أفكر في هذا السؤال.

  3. Pinochos

    المرأة تريد الكثير ولكن من رجل واحد والرجل يريد واحد ولكن من كثير من النساء. لديك شيء واحد جيد: يقسم المؤخرة إلى المؤخرة. كثرة النساء التدخين ضار ، والشرب مقرف ، لكن الموت بصحة جيدة أمر مؤسف. النقش تحت الصمام الحابس في قطار الأنفاق: إذا كنت تشعر بالكسل في الذهاب ، اسحب هذا الشيء اللعين. لم ننتهي في الجامعات !!! لا تفك أزرار سروالك على فم شخص آخر! Win95 مثل الطائرة - مريضة ، لكن لا مكان تذهب إليه! كوميديا ​​Fenita اللعينة

  4. Torean

    محتمل.

  5. Daelan

    هذه هي العبارة الثمينة

  6. Richardo

    بالضبط! تعجبني هذه الفكرة ، أنا أتفق معك تمامًا.



اكتب رسالة