معلومة

لماذا مطلوب كميات كبيرة من الحمض النووي للتحليل؟

لماذا مطلوب كميات كبيرة من الحمض النووي للتحليل؟


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

أعلم أن تفاعل البوليميراز المتسلسل يستخدم لإنشاء كميات كبيرة من نسخ الجينات وأنه إنجاز علمي ولكني أريد أن أفهم السبب. لماذا نحتاج إلى كميات كبيرة من الحمض النووي حتى نتمكن من تحليله والاستفادة منه. ألا يكفي جزيء DNA واحد؟


أولاً ، عينة الحمض النووي التي تم الحصول عليها من خلية أو أي شيء لن تحتوي أبدًا على تسلسل الحمض النووي الذي تريده ، ولكنها ستحتوي بدلاً من ذلك على الحمض النووي الجيني بأكمله ، والبلازميدات ، وتسلسل الحمض النووي الريبي وما إلى ذلك. باستخدام PCR ، يمكنك بشكل انتقائي مضاعفة كمية تسلسل الحمض النووي المطلوب بينما لا يتم نسخ التسلسلات غير المرغوب فيها. حافظ على استمرار PCR لفترة طويلة بما يكفي وستصبح كمية الحمض النووي غير المرغوب فيها مقابل تسلسل الحمض النووي المرغوب فيه ضئيلة. في هذه المرحلة ، يمكنك القيام بأي تجربة تريدها باستخدام عينة الحمض النووي الخاصة بك والتأكد بشكل معقول من أن أي نتيجة تحصل عليها ناتجة تمامًا عن تسلسل اهتمامك في الحمض النووي.

ثانيًا ، حتى لو استطعت عزل جزيء DNA واحد ماذا ستفعل به؟ لا يمكنك تحديد طوله عن طريق الرحلان الكهربائي للهلام لأن جزيء الحمض النووي الفردي لن يصنع شريطًا مرئيًا ، ومن المرجح أن يفشل بناءه في بلازميد لأنك تحصل على فرصة واحدة فقط. ربما لن تكون قادرًا على معرفة أن لديك جزيء DNA لأن الآلات الموجودة في مختبرك اليومي ليست حساسة بما يكفي لاكتشاف جزيء DNA واحد.

ثالثًا ، يسمح لك امتلاك كمية كبيرة من الحمض النووي بإجراء تجارب مختلفة من نفس العينة. معظم طرق تحليل الحمض النووي التي أعرفها مدمرة من حيث أن الحمض النووي المستخدم لا يمكن إعادة استخدامه في تجربة أخرى ، لذا فإن كمية كبيرة بما يكفي من الحمض النووي لإجراء جميع التجارب المخطط لها دون الحاجة إلى الحصول على عينة جديدة (وإدخال جميع أنواع المشاكل المحتملة) مفيد.

لذلك ، باختصار ، يسمح لنا تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) بتصفية تسلسل الحمض النووي المطلوب من عينة ، وإجراء تحليل ذي مغزى على هذا التسلسل ويتيح لنا استخدام عينة واحدة لتجارب متعددة. قد يكون هناك المزيد من المزايا لـ PCR التي فاتني ولكن هذه المزايا التي ظهرت في الذهن.


تعتمد العديد من الطرق المستخدمة لتصور وجود الحمض النووي ، مثل الرحلان الكهربائي للهلام ، على التحليل البصري سواء بالعين البشرية أو بالآلة. مطلوب كمية كبيرة من الحمض النووي تتجاوز ما يمكن استخراجه مباشرة من مصدر معين لهذا الغرض. تتفاقم هذه الحاجة بسبب حقيقة أن الحمض النووي ينقسم عادة إلى أجزاء لتحليلها.

قم بالتمرير بالقرب من الجزء السفلي من هذا الرابط لمشاهدة مثال على مادة هلامية. https://en.wikipedia.org/wiki/Gel_electrophoresis


RFLP وتطبيقات تحليل الحمض النووي

تعدد الأشكال لطول جزء التقييد (RFLP) هي طريقة جزيئية للتحليل الجيني تسمح بتحديد هوية الأفراد بناءً على أنماط فريدة من قطع إنزيم التقييد في مناطق معينة من الحمض النووي.

يشار إلى هذه التقنية أيضًا باسم تحليل RFLP ، وهي تستفيد من تعدد الأشكال في الرموز الجينية للأفراد. على الرغم من أن جميع أعضاء النوع لديهم أساسًا نفس التركيب الجيني ، فإن هذه الاختلافات الطفيفة تفسر الاختلافات في النمط الظاهري ، مثل المظهر أو التمثيل الغذائي ، بين الأفراد.


لماذا مطلوب كميات كبيرة من الحمض النووي للتحليل؟ - مادة الاحياء

الشكل 1. اكتشف فريدريك ميشر (1844-1895) الأحماض النووية.

بدأ فهمنا الحالي للحمض النووي باكتشاف الأحماض النووية متبوعًا بتطوير نموذج الحلزون المزدوج. في ستينيات القرن التاسع عشر ، قام فريدريش ميشر (الشكل 1) ، وهو طبيب حسب المهنة ، بعزل المواد الكيميائية الغنية بالفوسفات من خلايا الدم البيضاء (الكريات البيض). أطلق على هذه المواد الكيميائية (والتي ستُعرف في النهاية باسم DNA) النوكلين لأنها كانت معزولة عن نوى الخلايا.

لرؤية Miescher يجري تجربة خطوة بخطوة ، انقر فوق هذه المراجعة لكيفية اكتشافه للدور الرئيسي للحمض النووي والبروتينات في النواة.

بعد نصف قرن ، في عام 1928 ، قدم عالم البكتيريا البريطاني فريدريك جريفيث تقريراً عن أول دليل على التحول البكتيري - وهي عملية يتم فيها امتصاص الحمض النووي الخارجي بواسطة الخلية ، وبالتالي تغيير شكلها وعلم وظائفها. أجرى جريفيث تجاربه مع العقدية الرئوية ، جرثومة تسبب الالتهاب الرئوي. عمل جريفيث مع سلالتين من هذه البكتيريا تسمى الخام (R) والملساء (S). (كان يطلق على نوعي الخلايا اسم "خشن" و "أملس" بعد ظهور مستعمراتهما التي نمت على صفيحة أجار مغذية.)

السلالة R غير مسببة للأمراض (لا تسبب المرض). سلالة S مسببة للأمراض (مسببة للمرض) ولها كبسولة خارج جدارها الخلوي. تسمح الكبسولة للخلية بالهروب من الاستجابات المناعية للفأر المضيف.

عندما حقن جريفيث سلالة S الحية في الفئران ، ماتوا من الالتهاب الرئوي. في المقابل ، عندما حقن جريفيث سلالة R الحية في الفئران ، نجوا. في تجربة أخرى ، عندما حقن الفئران بسلالة S القاتلة للحرارة ، نجوا أيضًا. أظهرت هذه التجربة أن الكبسولة وحدها لم تكن سبب الوفاة. في مجموعة ثالثة من التجارب ، تم حقن مزيج من سلالة R الحية وسلالة S القاتلة بالحرارة في الفئران ، وماتت الفئران لدهشته. عند عزل البكتيريا الحية من الفئران الميتة ، تم استرداد سلالة البكتيريا فقط. عندما تم حقن هذه السلالة المعزولة في الفئران الطازجة ، ماتت الفئران. استنتج جريفيث أن شيئًا ما قد انتقل من سلالة S القاتلة للحرارة إلى سلالة R الحية وحولها إلى سلالة S المسببة للأمراض. أطلق على هذا اسم مبدأ التحويل (الشكل 2). تُعرف هذه التجارب الآن باسم تجارب تحويل Griffith & # 8217s.

الشكل 2. سلالتان من الرئوية الرئوية تم استخدامها في تجارب التحول الخاصة بجريفيث. سلالة R غير مسببة للأمراض. السلالة S مسببة للأمراض وتسبب الوفاة. عندما قام جريفيث بحقن فأر بسلالة S القاتلة للحرارة وسلالة R حية ، مات الفأر. تم انتشال سلالة S من الفأر الميت. وهكذا ، خلص جريفيث إلى أن شيئًا ما قد انتقل من سلالة S القاتلة للحرارة إلى سلالة R ، مما أدى إلى تحويل سلالة R إلى سلالة S في هذه العملية. (الائتمان & # 8220living mouse & # 8221: تعديل العمل عن طريق الائتمان NIH & # 8220 الماوس الميت & # 8221: تعديل العمل بواسطة Sarah الزواج)

كان العلماء أوزوالد أفيري وكولين ماكليود وماكلين مكارتي (1944) مهتمين باستكشاف مبدأ التحول هذا بشكل أكبر. قاموا بعزل سلالة S من الفئران الميتة وعزلوا البروتينات والأحماض النووية (RNA و DNA) لأن هذه كانت مرشحة محتملة لجزيء الوراثة. استخدموا الإنزيمات التي أدت إلى تحلل كل مكون على وجه التحديد ثم استخدموا كل خليط على حدة لتحويل سلالة R. وجدوا أنه عندما يتحلل الحمض النووي ، لم يعد الخليط الناتج قادرًا على تحويل البكتيريا ، في حين أن جميع التوليفات الأخرى كانت قادرة على تحويل البكتيريا. قادهم هذا إلى استنتاج أن الحمض النووي هو مبدأ التحول.

علماء الطب الشرعي وتحليل الحمض النووي

استخدم علماء الطب الشرعي أدلة تحليل الحمض النووي لأول مرة لحل قضية الهجرة. بدأت القصة مع صبي مراهق عاد إلى لندن من غانا ليكون مع والدته. شككت سلطات الهجرة في المطار به ، معتقدة أنه يسافر بجواز سفر مزور. بعد الكثير من الإقناع ، سُمح له بالعيش مع والدته ، لكن سلطات الهجرة لم تسقط القضية المرفوعة ضده. تم تقديم جميع أنواع الأدلة ، بما في ذلك الصور ، إلى السلطات ، لكن إجراءات الترحيل بدأت رغم ذلك. في نفس الوقت تقريبًا ، اخترع الدكتور أليك جيفريز من جامعة ليستر في المملكة المتحدة تقنية تُعرف ببصمة الحمض النووي. اتصلت سلطات الهجرة بالدكتور جيفريز طلبًا للمساعدة. أخذ عينات من الحمض النووي من الأم وثلاثة من أطفالها ، بالإضافة إلى أم ليس لها صلة قرابة ، وقارن العينات بالحمض النووي للصبي. لأن الأب البيولوجي لم يكن في الصورة ، تمت مقارنة الحمض النووي للأطفال الثلاثة مع الحمض النووي للصبي. وجد تطابقًا في الحمض النووي للصبي لكل من الأم وإخوته الثلاثة. وخلص إلى أن الصبي كان بالفعل ابن الأم.

يقوم علماء الطب الشرعي بتحليل العديد من العناصر ، بما في ذلك المستندات والكتابة اليدوية والأسلحة النارية والعينات البيولوجية. إنهم يحللون محتوى الحمض النووي للشعر ، والسائل المنوي ، واللعاب ، والدم ، ويقارنوه بقاعدة بيانات لمحات الحمض النووي الخاصة بالمجرمين المعروفين. يشمل التحليل عزل الحمض النووي ، والتسلسل ، وتحليل التسلسل. من المتوقع أن يظهر علماء الطب الشرعي في جلسات المحكمة لعرض نتائجهم. عادة ما يتم توظيفهم في مختبرات الجريمة في الوكالات الحكومية في المدينة والولاية. يعمل علماء الوراثة الذين يجربون تقنيات الحمض النووي أيضًا مع المنظمات العلمية والبحثية والصناعات الدوائية ومختبرات الكليات والجامعات. يجب على الطلاب الذين يرغبون في ممارسة مهنة كعالم في الطب الشرعي أن يكونوا حاصلين على الأقل على درجة البكالوريوس في الكيمياء أو البيولوجيا أو الفيزياء ، ويفضل أن يكون لديهم بعض الخبرة في العمل في المختبر.

على الرغم من أن تجارب Avery و McCarty و McLeod قد أثبتت أن الحمض النووي هو المكون المعلوماتي الذي تم نقله أثناء التحول ، إلا أن الحمض النووي لا يزال يعتبر جزيءًا بسيطًا جدًا بحيث لا يمكنه حمل المعلومات البيولوجية. اعتبرت البروتينات ، مع 20 من الأحماض الأمينية المختلفة ، مرشحة أكثر ترجيحًا. قدمت التجربة الحاسمة ، التي أجرتها مارثا تشيس وألفريد هيرشي في عام 1952 ، دليلاً مؤكداً على أن الحمض النووي هو بالفعل المادة الجينية وليس البروتينات. كان تشيس وهيرشي يدرسان العاثية - وهو فيروس يصيب البكتيريا. عادة ما يكون للفيروسات بنية بسيطة: غلاف بروتيني ، يسمى القفيصة ، ولب حمض نووي يحتوي على المادة الوراثية (إما DNA أو RNA). تصيب العاثية الخلية البكتيرية المضيفة عن طريق الالتصاق بسطحها ، ثم تقوم بحقن أحماضها النووية داخل الخلية. يصنع الحمض النووي للعاثية نسخًا متعددة من نفسه باستخدام الآلية المضيفة ، وفي النهاية تنفجر الخلية المضيفة ، وتطلق عددًا كبيرًا من العاثيات. اختار هيرشي وتشيس العناصر المشعة التي تميز البروتين على وجه التحديد عن الحمض النووي في الخلايا المصابة. قاموا بتسمية دفعة واحدة من الملتهمة بالكبريت المشع ، 35 ثانية ، لتسمية غلاف البروتين. تم تصنيف دفعة أخرى من العاثيات بالفوسفور المشع ، 32 P. لأن الفوسفور موجود في الحمض النووي ، ولكن ليس البروتين ، فإن الحمض النووي وليس البروتين سيتم تمييزه بالفوسفور المشع. وبالمثل ، فإن الكبريت غائب في الحمض النووي ، ولكنه موجود في العديد من الأحماض الأمينية مثل الميثيونين والسيستين.

تم السماح لكل دفعة من الملتهمة بإصابة الخلايا بشكل منفصل. بعد الإصابة ، تم وضع المعلق البكتيري في الخلاط ، مما تسبب في انفصال طبقة الملتهمة عن الخلية المضيفة. ثم تم فحص الخلايا المكشوفة لفترة كافية لحدوث العدوى لمعرفة أي من الجزيئين المشعين قد دخل الخلية. تم تدوير العاثية والمعلق البكتيري في جهاز طرد مركزي. استقرت الخلايا البكتيرية الأثقل وشكلت حبيبات ، بينما بقيت جسيمات العاثية الأخف في المادة الطافية. في الأنبوب الذي يحتوي على الملتهمة المسمى بـ 35 ثانية ، احتوى الطاف على الملتهمة المسمى إشعاعيًا ، بينما لم يتم الكشف عن أي نشاط إشعاعي في الحبيبات. في الأنبوب الذي يحتوي على الملتهمة المسمى بـ 32 P ، تم الكشف عن النشاط الإشعاعي في الحبيبات التي تحتوي على خلايا بكتيرية أثقل ، ولم يتم الكشف عن أي نشاط إشعاعي في المادة الطافية. خلص هيرشي وتشيس إلى أن الحمض النووي للعاثية هو الذي تم حقنه في الخلية وحمل المعلومات لإنتاج المزيد من جزيئات العاثيات ، وبالتالي تقديم دليل على أن الحمض النووي هو المادة الوراثية وليس البروتينات (الشكل 3).

الشكل 3. في تجربتي Hershey و Chase & # 8217s ، أصيبت البكتيريا بالعاثية الملصقة إشعاعيًا إما بـ 35S ، الذي يصف البروتين ، أو 32P ، الذي يسمي الحمض النووي. دخلت الخلايا البكتيرية 32P فقط ، مما يشير إلى أن الحمض النووي هو المادة الوراثية.

في نفس الوقت تقريبًا ، قام عالم الكيمياء الحيوية النمساوي Erwin Chargaff بفحص محتوى الحمض النووي في الأنواع المختلفة ووجد أن كميات الأدينين والثايمين والجوانين والسيتوزين لم يتم العثور عليها بكميات متساوية ، وأن التركيزات النسبية لقواعد النوكليوتيدات الأربعة تختلف عن الأنواع. للأنواع ، ولكن ليس داخل أنسجة نفس الفرد أو بين أفراد من نفس النوع. اكتشف أيضًا شيئًا غير متوقع: أن كمية الأدينين تساوي كمية الثايمين ، وكمية السيتوزين تساوي كمية الجوانين (أي ، A = T و G = C). الأنواع المختلفة لها كميات متساوية من البيورينات (A + G) و بيريميدين (T + C) ، لكن نسب مختلفة من A + T إلى G + C. أصبحت هذه الملاحظات معروفة باسم قواعد المسؤول . أثبتت نتائج Chargaff & # 8217s أنها مفيدة للغاية عندما كان Watson و Crick يستعدان لاقتراح نموذج اللولب المزدوج للحمض النووي! يمكنك أن ترى بعد قراءة الصفحات القليلة الماضية كيف يبني العلم على الاكتشافات السابقة ، أحيانًا في عملية بطيئة وشاقة.

سؤال الممارسة

ساعدت التجارب التي أجراها هيرشي وتشيس على تأكيد أن الحمض النووي كان مادة وراثية على أساس النتيجة:

  1. تم العثور على الملتهمة المشعة في الحبيبات
  2. تم العثور على الخلايا المشعة في طاف
  3. تم العثور على الكبريت المشع داخل الخلية
  4. تم العثور على الفوسفور المشع في الخلية

باختصار: تاريخ الحمض النووي

تم عزل الحمض النووي لأول مرة من خلايا الدم البيضاء بواسطة فريدريش ميشر ، الذي أطلق عليه اسم nuclein لأنه تم عزله من النوى. فريدريك جريفيث & # 8217s مع سلالات من العقدية الرئوية قدم أول تلميح إلى أن الحمض النووي قد يكون هو مبدأ التحول. أثبت Avery و MacLeod و McCarty أن الحمض النووي ضروري لتحول البكتيريا. أثبتت التجارب اللاحقة التي أجراها هيرشي وتشيس باستخدام العاثية T2 أن الحمض النووي هو المادة الوراثية. وجد Chargaff أن نسبة A = T و C = G وأن النسبة المئوية لمحتوى A و T و G و C تختلف باختلاف الأنواع.


عندما يصبح المرء اثنين: فصل الحمض النووي لتحليل أكثر دقة للثقوب النانوية

ستساعد أداة برمجية جديدة طورها باحثو معهد إيرلهام علماء المعلومات الحيوية على تحسين جودة ودقة بياناتهم البيولوجية ، وتجنب التجميعات الخاطئة. تصور الأداة السريعة وخفيفة الوزن وسهلة الاستخدام مجموعات الجينوم ومحاذاة الجينات من أحدث تقنيات التسلسل من الجيل التالي.

تدعى أداة التصور الجديدة Alvis ، وهي تفحص التعيينات بين بيانات تسلسل الحمض النووي وقواعد بيانات الجينوم المرجعية. يسمح هذا لعلماء المعلومات الحيوية بتحليل بياناتهم الناتجة عن مهام وتنسيقات الجينوميات الشائعة بسهولة أكبر من خلال إنتاج صور متجهية فعالة وجاهزة.

قال المؤلف الأول وعالم ما بعد الدكتوراه في معهد إيرلهام الدكتور صموئيل مارتن من مجموعة Leggett: "عادةً ما تقوم أدوات المحاذاة بإخراج ملفات نصية عادية تحتوي على قوائم بيانات المحاذاة. وهذا أمر رائع لتحليل الكمبيوتر ولإدراجه في خط الأنابيب ، ولكن قد يكون من الصعب تفسيرها من قبل البشر.

"يمكن أن يساعدنا تصور بيانات المحاذاة في فهم المشكلة المطروحة. وكتقنية جديدة ، تم تنفيذ العديد من تنسيقات المحاذاة الجديدة بواسطة أدوات جديدة خاصة بتقنية تسلسل المسام النانوية.

"وجدنا أن أدوات التصور الحالية لم تكن قادرة على تفسير هذه التنسيقات يمكن استخدام Alvis مع جميع تنسيقات المحاذاة الشائعة ، ويمكن توسيعها بسهولة للتنسيقات المستقبلية."

الميزة الرئيسية لأداة سطر الأوامر الجديدة هي قدرتها الفريدة على إبراز التسلسلات الكيمرية تلقائيًا - الروابط الضعيفة في سلسلة الحمض النووي. هذا هو المكان الذي يتم فيه ربط تسلسلين - من أجزاء مختلفة من الجينوم أو أنواع مختلفة - معًا عن طريق الخطأ لإنشاء واحد ، مما يؤثر على دقة البيانات.

يمكن أن تكون تسلسل الكيميرا مشكلة بالنسبة لعلماء المعلومات الحيوية عند تحديد الحمض النووي المحدد. يمكن أن يحدث تكوين الكيميرا ماديًا لجزيئات الحمض النووي أثناء إعداد مكتبة التسلسل ، وأثناء عملية التسلسل على بعض المنصات ، وعن طريق أدوات التجميع عند محاولة تجميع الجينوم معًا.

أثناء تطوير الأداة ، قارن الفريق مجموعات الجينوم مع وبدون استخدام اكتشاف Alvis chimera. تُظهر الصورة المتجهة الناتجة مثالًا للإخراج ، حيث تتعقب الأداة البديهية جميع القراءات التي تتعرف عليها على أنها chimeras.

قال الدكتور مارتن: "على الرغم من أن التسلسلات الكيميرية لا تشكل نسبة كبيرة من العينات ، إلا أنه يمكن أن يكون لها تأثير كبير ، لذلك علينا توخي الحذر لأننا حددناها أثناء التحليل".

"في مثال مخطط ألفيس لبيانات الوهم ، يمثل كل مستطيل عبر الصفحة قراءة ، وتمثل الكتل الملونة بداخلها محاذاة. من السهل رؤية معظم الكيميرات لأن محاذاةها ألوان مختلفة ، مما يعني أنها ترسم لجينومات مختلفة. والبعض الآخر أكثر دقة لأن كلا المحاذاة لنفس الجينوم ، لكن مناطق مختلفة. "

يمكن لأداة Alvis تحديد تصور متواليات خيالية فقط لمزيد من الفحص ، وإخراج البيانات الرقمية التي تصف الكيميرات. يوضح هذا أنه من خلال تطبيق الأداة ثم تقسيم الوهم بطريقة معلوماتية حيوية ، يتم تحسين جودة التجميعات بشكل كبير.

يضيف الدكتور مارتن ، الذي تم الوصول إليه أكثر من 600 مرة منذ أن أصبح متاحًا في بداية شهر مارس من هذا العام: "نأمل أن يستمر Alvis في كونه مفيدًا للباحثين الآخرين الذين يعملون ، على سبيل المثال ، في تسلسل المسامير النانوية لتحسين فهمهم لبياناتهم من خلال تصور المحاذاة. ، ".

"تعد عمليات المحاذاة أساسية جدًا للمعلوماتية الحيوية بحيث يمكن أن تكون مفيدة لأي شخص يعمل ببيانات تسلسل قراءة طويلة ، بالإضافة إلى المحاذاة الناتجة عن تسلسل البيانات من منصات القراءة القصيرة. ويمكن بسهولة تصدير المخططات التي ينشئها Alvis لاستخدامها مباشرة في المنشورات ، أظهر في دراستنا بالفعل ".


ما هو PCR المستخدمة؟

بمجرد تضخيمه ، يمكن استخدام الحمض النووي الناتج عن تفاعل البوليميراز المتسلسل في العديد من الإجراءات المختبرية المختلفة. على سبيل المثال ، اعتمدت معظم تقنيات رسم الخرائط في مشروع الجينوم البشري (HGP) على تفاعل البوليميراز المتسلسل.

يعتبر تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) مفيدًا أيضًا في عدد من التقنيات المختبرية والسريرية ، بما في ذلك بصمات الحمض النووي ، واكتشاف البكتيريا أو الفيروسات (خاصة الإيدز) ، وتشخيص الاضطرابات الوراثية.

بمجرد تضخيمه ، يمكن استخدام الحمض النووي الناتج عن تفاعل البوليميراز المتسلسل في العديد من الإجراءات المختبرية المختلفة. على سبيل المثال ، اعتمدت معظم تقنيات رسم الخرائط في مشروع الجينوم البشري (HGP) على تفاعل البوليميراز المتسلسل.

يعتبر تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) مفيدًا أيضًا في عدد من التقنيات المختبرية والسريرية ، بما في ذلك بصمات الحمض النووي ، واكتشاف البكتيريا أو الفيروسات (خاصة الإيدز) ، وتشخيص الاضطرابات الوراثية.


من اكتشف بنية الحمض النووي؟

تم اكتشاف البنية الحلزونية المزدوجة للحمض النووي لأول مرة في عام 1953 من قبل جيمس واتسون (عالم أحياء أمريكي) ، وفرانسيس كريك (فيزيائي إنجليزي) ، وروزاليند فرانكلين (كيميائية إنجليزية). على الرغم من أن واتسون وكريك فقط كان لهما الفضل في اكتشاف الحلزون المزدوج ، إلا أنه يعتقد أنهما قاما باكتشافهما بمساعدة بيانات فرانكلين. كانت فرانكلين خبيرة في تقنية تصوير تسمى علم البلورات بالأشعة السينية ، والتي استخدمتها لإنتاج أول صورة على الإطلاق للشكل الحلزوني للحمض النووي.

مُنح واتسون وكريك جائزة نوبل عن عملهما في عام 1962. على الرغم من مساهمتها في الاكتشاف ، لم تُمنح فرانكلين الجائزة ، بعد أن توفيت بمرض السرطان قبل أربع سنوات.


أسئلة معمل مسبق

ناقش ما يلي فيما بينكم. كن مستعدًا لمشاركة أفكارك مع بقية الفصل.

  1. الأمبيسلين مشتق من البنسلين المضاد الحيوي. يعطل تكوين جدار الخلية في الخلايا البكتيرية التي تقتل الخلايا. ومع ذلك ، يحتوي البلازميد المأشوب لدينا على جين يوفر مقاومة للمضادات الحيوية عن طريق إنتاج بروتين يكسر الأمبيسلين. لماذا نقوم بتضمين الأمبيسلين في وسط الاختبار؟
  2. ماذا سيحدث إذا لم تنمو الخلايا المحولة في وجود المحفز الكيميائي؟
  3. في التجربة ، ستضيف مجموعات الخلايا الضابطة والتجريبية إلى مجموعات وسائط مختلفة. ماذا تتوقع لكل حالة؟ أملأ الجدول 1 من خلال الإشارة إلى ما إذا كنت تتوقع نموًا أم لا ، وإذا كان هناك نمو ، فهل سيكون هناك نمو ضئيل أو كثير من النمو.

اقرأ الإجراءات أدناه وحدد الخطوات ، باستخدام الكلمات ومخطط انسيابي في دفتر ملاحظات المختبر الخاص بك.


كيف يتم ترتيب الحمض النووي في الخلية

الحمض النووي هو جزيء عامل يجب نسخه عندما تكون الخلية جاهزة للانقسام ، ويجب "قراءته" لإنتاج الجزيئات ، مثل البروتينات ، لتقوم بوظائف الخلية. لهذا السبب ، فإن الحمض النووي محمي ومعبأ بطرق محددة للغاية. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن تكون جزيئات الحمض النووي طويلة جدًا. امتدت جزيئات الحمض النووي من طرف إلى طرف في خلية بشرية واحدة طوله حوالي 2 متر. وبالتالي ، يجب تعبئة الحمض النووي للخلية بطريقة منظمة للغاية لتلائم وتعمل داخل بنية (الخلية) غير مرئية للعين المجردة. تعتبر كروموسومات بدائيات النوى أبسط بكثير من تلك الموجودة في حقيقيات النوى في العديد من ميزاتها (الشكل 9.6). تحتوي معظم بدائيات النوى على كروموسوم دائري واحد موجود في منطقة في السيتوبلازم تسمى النواة.

الشكل 9.6 يحتوي حقيقيات النوى على نواة محددة جيدًا ، بينما في بدائيات النوى ، يكمن الكروموسوم في السيتوبلازم في منطقة تسمى النواة.

حجم الجينوم في واحدة من بدائيات النوى الأكثر دراسة ، الإشريكية القولونية، 4.6 مليون زوج قاعدي ، والتي من شأنها أن تمتد لمسافة حوالي 1.6 ملم إذا امتدت. فكيف يتناسب هذا داخل خلية بكتيرية صغيرة؟ يتم التواء الحمض النووي إلى ما بعد الحلزون المزدوج فيما يعرف باسم الالتواء الفائق. من المعروف أن بعض البروتينات تشارك في الالتفاف الفائق للبروتينات والإنزيمات الأخرى التي تساعد في الحفاظ على البنية فائقة الالتفاف.

تستخدم حقيقيات النوى ، التي تتكون كل كروموسوماتها من جزيء دنا خطي ، نوعًا مختلفًا من استراتيجية التعبئة لتلائم الحمض النووي الخاص بها داخل النواة. على المستوى الأساسي ، يتم لف الحمض النووي حول البروتينات المعروفة باسم الهيستونات لتشكيل هياكل تسمى الجسيمات النووية. يتم لف الحمض النووي بإحكام حول قلب هيستون. يرتبط هذا الجسيم بالنيوكليوسوم التالي بواسطة خيط قصير من الحمض النووي الخالي من الهستونات. يُعرف هذا أيضًا باسم بنية "الخرز على الخيط" ، وتكون النيوكليوسومات هي "الخرزات" والأطوال القصيرة للحمض النووي بينها هي "الخيط". تتراكم النيوكليوسومات ، مع دناها الملتف حولها ، بشكل مضغوط على بعضها البعض لتشكيل ألياف بعرض 30 نانومتر. يتم لف هذه الألياف أيضًا في هيكل أكثر سمكًا وأكثر إحكاما. في المرحلة الأولية من الانقسام الفتيلي ، عندما تصطف الكروموسومات في وسط الخلية ، تكون الكروموسومات في أكثر حالاتها ضغطًا. يبلغ عرضها 700 نانومتر تقريبًا ، وتوجد مقترنة ببروتينات السقالة.

في الطور البيني ، مرحلة دورة الخلية بين التخفيف الذي يتم فيه فصل الكروموسومات ، تحتوي الكروموسومات حقيقية النواة على منطقتين متميزتين يمكن تمييزهما عن طريق التلوين. هناك منطقة معبأة بإحكام تتلطخ بشكل غامق ، ومنطقة أقل كثافة. تحتوي مناطق التلوين الداكن عادةً على جينات غير نشطة ، وتوجد في مناطق السنترومير والتيلوميرات. تحتوي مناطق التلوين الخفيف عادةً على جينات نشطة ، مع حزم الحمض النووي حول النيوكليوسومات ولكن لا يتم ضغطها بشكل أكبر.

يوضح الشكل 9.7 هذه الأرقام انضغاط كروموسوم حقيقيات النواة.


الهندسة الوراثية في النباتات

بسبب أهميتها الاقتصادية ، كانت النباتات لفترة طويلة موضوع تحليل وراثي يهدف إلى تطوير أصناف محسّنة. لقد أدخلت تقنية الحمض النووي المؤتلف بعدًا جديدًا لهذا الجهد لأن تعديلات الجينوم التي أتاحتها هذه التكنولوجيا لا حدود لها تقريبًا. لم يعد التكاثر يقتصر على اختيار المتغيرات داخل نوع معين. يمكن الآن إدخال الحمض النووي من أنواع أخرى من النباتات أو الحيوانات أو حتى البكتيريا.

تي بلازميد. & # x02003 & # x02003

يتم اشتقاق النواقل الوحيدة المستخدمة بشكل روتيني لإنتاج نباتات معدلة وراثيًا من بكتيريا التربة تسمى أغروباكتريوم توميفاسيانز. تسبب هذه البكتيريا ما يعرف باسم مرض تاج المرارة ، حيث ينتج النبات المصاب نموًا غير متحكم فيه (أورام أو عوارض) ، عادةً في قاعدة (تاج) النبات. مفتاح إنتاج الورم هو بلازميد DNA دائري كبير (200 كيلو بايت) & # x02014 بلازميد Ti (تحريض الورم). عندما تصيب البكتيريا خلية نباتية ، يتم نقل جزء من بلازميد Ti & # x02014 منطقة تسمى T-DNA & # x02014 وإدخاله ، على ما يبدو بشكل عشوائي إلى حد ما ، في جينوم النبات المضيف (الشكل 13-14 ). تكون الوظائف المطلوبة لهذا النقل خارج T-DNA على بلازميد Ti. يحمل T-DNA نفسه العديد من الوظائف المثيرة للاهتمام ، بما في ذلك إنتاج الورم وتخليق المركبات التي تسمى يرى. يتم تصنيع الفتحات في الواقع إلى النبات المضيف تحت إشراف T-DNA. ثم تستخدم البكتيريا الأوبينات لأغراضها الخاصة ، وتستدعي الجينات التي تستخدم الأفيون على بلازميد Ti. اثنان مهمان هما nopaline و octopine اثنان منفصلان Ti plasmids ينتجانهما. يظهر هيكل Ti في الشكل 13-15.

الشكل 13-14

في عملية التسبب في مرض مرارة التاج ، البكتيريا A. الورم يدخل جزءًا من Ti plasmid & # x02014 منطقة تسمى T-DNA & # x02014 في كروموسوم النبات المضيف.

الشكل 13-15

تمثيل مبسط للمناطق الرئيسية لبلازميد Ti لـ A. الورم. عندما يتم إدخال T-DNA في الحمض النووي الكروموسومي للنبات المضيف ، فإنه يوجه تركيب النوبالين ، والذي تستخدمه البكتيريا بعد ذلك لأغراضها الخاصة. T-DNA (المزيد)

إن السلوك الطبيعي لبلازميد Ti يجعله مناسبًا تمامًا لدور ناقل النبات. إذا كان من الممكن تقطيع الحمض النووي محل الاهتمام في T-DNA ، فسيتم إدخال الحزمة بأكملها في حالة مستقرة في كروموسوم النبات. لقد تم بالفعل جعل هذا النظام يعمل بشكل أساسي بهذه الطريقة ، ولكن مع بعض التعديلات اللازمة. دع & # x02019s نفحص بروتوكولًا واحدًا.

تعتبر بلازميدات Ti كبيرة جدًا بحيث لا يمكن معالجتها بسهولة ولا يمكن تصغيرها بسهولة ، لأنها تحتوي على عدد قليل من مواقع التقييد الفريدة. وبالتالي ، يتلقى ناقل وسيط أصغر في البداية إدخال الفائدة والجينات المختلفة والشرائح اللازمة لإعادة التركيب والتكاثر ومقاومة المضادات الحيوية. عندما يتم هندستها باستخدام عناصر الجينات المرغوبة ، يمكن بعد ذلك إدخال هذا المتجه الوسيط في بلازميد Ti ، مكونًا بلازميدًا مشتركًا يمكن إدخاله في خلية نباتية عن طريق التحويل. يوضح الشكل 13-16 أ طريقة واحدة لتكوين التكامل المشترك. يتم أولاً تخفيف بلازميد Ti الذي سيتلقى الناقل الوسيط ، أي أنه يحتوي على المنطقة اليمنى بالكامل من T-DNA ، بما في ذلك جينات الورم وجينات التوليف nopaline ، التي تم حذفها ، مما يجعلها غير قادرة على تكوين الورم & # x02014 a & # x0201cnuisance & # x0201d جانب من وظيفة T-DNA. إنه يحتفظ بالحد الأيسر من T-DNA الخاص به ، والذي سيتم استخدامه كموقع تقاطع لتضمين المتجه الوسيط. يحتوي المتجه الوسيط على مقطع استنساخ مناسب مقسم ، يحتوي على مجموعة متنوعة من مواقع التقييد الفريدة. تم إدخال الجين المعني في هذا الموقع في الشكل 13-16. كما يتم تقطيع الجين البكتيري المختار (spc R) لمقاومة سبيكتينوميسين ، الجين البكتيري المقاوم للكاناميسين (كان R) ، المصممة للتعبير في النباتات وقطعتين من T-DNA. جزء واحد يحمل جين التوليف النوبالين (رقم) بالإضافة إلى تسلسل الحدود T-DNA الأيمن. يأتي الجزء الثاني من T-DNA بالقرب من الحد الأيسر ويوفر قسمًا لإعادة التركيب مع جزء متماثل من منطقة اليد اليسرى ، والذي تم الاحتفاظ به في بلازميد Ti المنزوع السلاح. بعد إدخال النواقل الوسيطة في أجروباكتريوم الخلايا التي تحتوي على بلازميدات Ti المنزوعة السلاح (عن طريق الاقتران مع بكتريا قولونية) ، يمكن اختيار المؤتلفات البلازميدية (cointegrates) عن طريق الطلاء على سبيكتينوميسين. سوف تحتوي المستعمرات البكتيرية المختارة على بلازميد Ti فقط ، لأن الناقل الوسيط غير قادر على التكاثر في الأجرعية.

الشكل 13-16

(أ) لإنتاج نباتات معدلة وراثيا ، يتم استخدام ناقل وسيط بحجم يمكن التحكم فيه لاستنساخ الجزء المعني. في الطريقة الموضحة هنا ، يتم إعادة تجميع المتجه الوسيط باستخدام بلازميد Ti المخفف (& # x0201cdisarmed & # x0201d) لتوليد (المزيد).

كما يوضح الشكل 13-16 ب ، بعد اختيار سبيكتينوميسين للدمام المشترك ، تُستخدم البكتيريا التي تحتوي على البلازميد المزدوج المؤتلف أو المشترك ، بعد ذلك لإصابة أجزاء مقطوعة من الأنسجة النباتية ، مثل أقراص الأوراق المثقوبة. إذا حدثت عدوى بكتيرية في الخلايا النباتية ، فيمكن إدخال أي مادة وراثية بين تسلسل T-DNA الحدودي الأيمن والأيسر في كروموسومات النبات. إذا تم وضع أقراص الأوراق على وسط يحتوي على كانامايسين ، فإن الخلايا النباتية الوحيدة التي ستخضع لانقسام الخلايا هي تلك التي اكتسبت كان الجين R من نقل T-DNA. ينتج عن نمو هذه الخلايا تكتل ، أو مسمار ، وهو مؤشر على حدوث التحول. يمكن تحفيز هذه الكالس لتكوين براعم وجذور ، وفي ذلك الوقت يتم نقلها إلى التربة حيث تتطور إلى نباتات معدلة وراثيًا (الشكل 13-16 ب). غالبًا ما يمكن اكتشاف إدخال T-DNA واحد فقط في مثل هذه النباتات ، حيث يفصل في الانقسام الاختزالي مثل أليل مندلي العادي (الشكل 13-17). يمكن الكشف عن الإدخال بواسطة مسبار T-DNA في التهجين الجنوبي أو يمكن التحقق منه عن طريق الكشف عن النوبالين الكيميائي في الأنسجة المعدلة وراثيا.

الشكل 13-17

يتم إدخال T-DNA وأي حمض نووي موجود بداخله في كروموسوم نباتي في النبات المعدل وراثيًا ثم ينتقل في نمط وراثي مندلي.

التعبير عن الحمض النووي المستنسخ

يمكن أن يكون الحمض النووي المستنسخ في T-DNA أي DNA يريد المحقق إدخاله في النبات المعني. إن الحمض النووي الغريب اللافت للنظر الذي تم إدخاله باستخدام T-DNA هو جين إنزيم luciferase المعزول من اليراعات. يحفز الإنزيم تفاعل مادة كيميائية تسمى لوسيفيرين مع ATP في هذه العملية ، ينبعث الضوء ، وهو ما يفسر سبب توهج اليراعات في الظلام. نبات التبغ المعدّل وراثيًا الذي يعبر عن جين لوسيفيراز سوف يتوهج أيضًا في الظلام عندما يسقي بمحلول لوسيفيرين (انظر الصورة في بداية هذا الفصل). قد يبدو مثل هذا التلاعب كمحاولة لتطوير تقنية لصنع أشجار عيد الميلاد التي لا تحتاج إلى أضواء ، ولكن في الواقع فإن جين لوسيفيراز مفيد كمراسل لمراقبة وظيفة أي جين أثناء التطور. بعبارة أخرى ، يمكن دمج تسلسل المحفز الأولي لأي جين مهم في جين لوسيفيراز ووضعه في النبات بواسطة T-DNA. ثم يتبع جين لوسيفيراز نفس النمط التطوري للجين المنظم بشكل طبيعي ، لكن جين لوسيفيراز سيعلن عن نشاطه بشكل بارز عن طريق التوهج في أوقات مختلفة أو في أنسجة مختلفة ، اعتمادًا على التسلسل التنظيمي.

الجينات الأخرى المستخدمة كمراسلين في النباتات هي البكتيريا GUS (& # x003b2-glucuronidase) ، الذي يحول مركب X-Gluc إلى اللون الأزرق ، والبكتيريا لاك (& # x003b2-galactosidase) الجين ، الذي يحول X-Gal إلى اللون الأزرق. تتحول الخلايا التي يتم فيها التعبير عن هؤلاء المراسلين إلى اللون الأزرق ، ويمكن رؤية هذا الزرقة بسهولة إما بالعين المجردة أو تحت المجهر.

النباتات المعدلة وراثيًا التي تحمل أيًا من مجموعة متنوعة من الجينات الأجنبية قيد الاستخدام حاليًا ، والعديد منها قيد التطوير. لا يتم التلاعب فقط بصفات النباتات نفسها ، ولكن ، مثل الكائنات الحية الدقيقة ، تُستخدم النباتات أيضًا كمصانع مريحة & # x0201cfactories & # x0201d لإنتاج بروتينات مشفرة بواسطة جينات أجنبية.


موجز عملي

الجلسة العملية الأولى

يتم تزويد كل مجموعة من الطلاب بعينة من البلازميد مع موقع EcoRI واحد والذي تبلغ قيمته حوالي 3 كيلو بايت. لقد استخدمنا pUC118 للبيانات الموضحة هنا. يقال لهم التركيز التقريبي للبلازميد و A.260 للحمض النووي المزدوج الذين تقطعت بهم السبل. بعد حساب التخفيف المناسب يقومون بإعداد قسامة 1 مل ، والتي تستخدم للحصول على A.260 و أ280 قراءة٪ s. يقومون الآن بحساب تركيز الحمض النووي الفعلي لعينتهم وإجراء سلسلة من التخفيفات التي ستعطي كميات معروفة من الحمض النووي لكل 10 ميكرولتر من محلول TE من 1 ميكروغرام إلى 1 نانوغرام. يتم خلط 10 ميكرولتر من التخفيفات مع 2 ميكرولتر من صبغة التحميل ، وتم تحميل العينات المختلطة في آبار هلام الاغاروز. بعد الرحلان الكهربائي ، يتم تلوين المواد الهلامية ببروميد إيثيديوم ، ويتم تصويرها تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية ، ويتم تسجيل الصورة لإعادتها إلى الطلاب لتفسيرها.

الجلسة العملية الثانية

في هذه الجلسة ، يتم تزويد الطلاب بعينات من البلازميد المستخدم في الجلسة الأولى وعينات من الحمض النووي الدائري مزدوج الشريطة (RFI) والدوران أحادي السلسلة (SS +) للعاثية M13.

تعالج كل مجموعة من الطلاب التعميم المغلق تساهميًا (ccc ، RFI) والحمض النووي الدائري أحادي السلسلة (SS +) للعاثية M13 مع DNA Topoisomerase I ومع نوكلياز داخلي التقييد EcoRI. يتم أيضًا معالجة DNA البلازميد (pUC118) باستخدام EcoRI ومع DNA Topoisomerase I. بعد الهضم ، يتم فصل الأشكال المختلفة من الحمض النووي M13 و pUC118 بواسطة الرحلان الكهربائي لهلام الاغاروز في غياب بروميد الإيثيديوم. المواد الهلامية ملطخة بعد الرحلان الكهربائي وتصور وتسجيلها كما في الجلسة الأولى.


مستقبل تحليل الحمض النووي

احتاجت تقنيات تحليل الحمض النووي الأولى إلى كميات كبيرة من الحمض النووي عالي الجودة إلى حد ما. ومع ذلك ، يمكن أن تؤدي الإجراءات الأحدث إلى نتائج الحمض النووي بعينات أصغر بكثير وأقل جودة وفي فترة زمنية أقصر بكثير. Techniques have also been developed to extract usable DNA from difficult-to-access or contaminated sources.

DNA analysis is still not fool-proof and there are instances when it doesn’t live up to expectations. Usually, DNA analysis provides insights or evidence, but it doesn’t always provide definitive answers. The interpretation of DNA results is still largely dependent on experts, but home DNA testing means that the information contained in your DNA is becoming more accessible and affordable all the time.

Dmitri Synogatch
Joseph Kim

You guys did FANTASTIC ! This really helped me understand more about this topic. you guys may not get a lot of credits but I would like to say thank you for your effort to give such information for average joes like us.

How can I start a DNA test lab in India?

Please let me know the procedure to start a DNA testing lab, the equipments required and the licensing authority.

Sonja jurisic

I am enquiring re my cousin who did DNA test. He got a large procentage for Balkan and Greece. Prior to Slavic move to Balkan, there were Ilyrian tribes in the area and others. What period does Balkan and Greek refers to, prior to Slavic move or after? شكرا لك
Sonja Jurisic

Mark Hicks

DNA has changed humanity to it’s extinction. It’s how they are thinning the heard.

Alexander abary

My basic knowledge of DNA analysis, after reading your monologue, is now comprehensive, understandably complete, that I can utilize in years to come. One crazy question: Can you tell a living creature to be half human and half animal belonging to the same species? Just my curiosity.


شاهد الفيديو: ما هو الحمض النووي DNA? (يوليو 2022).


تعليقات:

  1. Ham

    قطعاً

  2. Zacharia

    لقد رأيته بالفعل في مكان ما

  3. Maed

    أعني أنك لست على حق. يمكنني الدفاع عن موقفي. اكتب لي في رئيس الوزراء ، سنتحدث.

  4. Aenedleah

    واكر ، يبدو لي أن هذه هي العبارة الرائعة

  5. Antalka

    أوافق ، فكرتك رائعة

  6. Bond

    أوافق ، رسالة مفيدة



اكتب رسالة