معلومة

تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) هو بلازميد مع مناطق ذاتية التكميل؟

تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) هو بلازميد مع مناطق ذاتية التكميل؟


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

أحاول إجراء اختبار تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام البلازميد كقالب ، أشياء أساسية جدًا. لكن المشكلة هي أن التمهيدي الأمامي الخاص بي يحدث فقط للارتباط بموقع آخر على البلازميد في الاتجاه العكسي ، بين موقع الربط الأمامي المناسب وموقع الربط العكسي. هذا ليس مثالًا على الارتباط غير المحدد ، التسلسلات مثالية لأن البلازميد يحتوي على مناطق ذاتية التكميل ، ويحدث التمهيدي الأمامي الخاص بي للتو على الأرض مباشرة.

هنا رسم تخطيطي:

من المحتمل ألا يساعد تحسين نقطة الانصهار أو تركيزات المغنيسيوم ببساطة ، لأن التسلسل هو نفسه. أقوم بهذا الاستنساخ لإدخال جين مراسل في المتجه ، وأحتاج إلى وضعه بدقة شديدة ، لذلك لا أعرف ما إذا كان بإمكاني طلب مجموعة جديدة من البادئات ، يجب أن يكون الإدخال مناسبًا هناك.

منتج PCR السيئ أقصر بحوالي 500 قاعدة من المنتج الجيد ، لكنني لا أرى سوى النطاق السيئ على الجل عندما أقوم بتشغيل PCR عادي. إذا قمت بتقليل كمية التمهيدي الأمامي وزادت من القلة العكسية ، يمكنني رؤية النطاق الجيد ، لكن الشريط السيئ لا يزال موجودًا والإنتاج الإجمالي أقل بكثير.

لذا فإن فكرتي الآن هي عمل PCR غير متماثل باستخدام التمهيدي العكسي فقط ، ثم إضافة التمهيدي الأمامي لإنشاء الحمض النووي المزدوج الشريطة ، ثم فصل العصابات الجيدة والسيئة باستخدام الرحلان الكهربائي للهلام. لكن ليس لدي أدنى فكرة عن عدد الدورات التي يجب أن أقوم بتشغيلها في كل خطوة ، أو مقدار التمهيدي الذي يجب إضافته ، وما إلى ذلك. بالإضافة إلى ذلك ، فإن PCR غير المتماثل له عائد منخفض بسبب التضخيم الحسابي ، ولكن بمجرد إضافة البادئات الأمامية ، يمكن أن يبدأ متماثل يعمل تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) وهندسيًا على تضخيم كلا النطاقين ، لكنني أعتقد أن النطاق السيئ الأقصر يفوز.

هل لدى أي شخص هنا خبرة في هذا النوع من تفاعل البوليميراز المتسلسل المعقد ، أو اقتراحات لتحسين حصولي؟


من التجربة ، لن تختفي مشكلتك الحالية تمامًا بغض النظر عما تفعله. فكرة وجود تفاعل البوليميراز المتسلسل غير المتماثل ليست فكرة سيئة. ومع ذلك ، ستحصل فقط على تضخيم خطي للمنتج المطلوب من الأساس الفردي الأولي ، لذلك لن "ترى" أي منتج حتى بعد 30-40 دورة. قد يتسبب PCR التمهيدي الأول هذا أيضًا في حدوث مشكلات في المراحل النهائية مع تضخيم المنتجات غير المرغوب فيها التي تم صنعها أثناء PCR الثاني (المنتجات غير المرغوب فيها).

أوافق على التعليق رقم 1 ، ولكن بعد ذلك قم بقص ملف "مرئي" الفرقة "جيدة" من الجل. قم بتعليق (سحق) شريط agarose في المخزن المؤقت TE المعقم ، ثم استخدم قسامة منه كقالب لـ PCR ثانوي (استخدم بادئات متساوية - ربما 30 دورة). يجب أن يوفر هذا أكثر من نموذج بداية "جيد" كافٍ.

بالتناوب ، يمكنك تصميم برايمر أمامي جديد لا يحتوي على موقع ثانوي سيئ على البلازميد الخاص بك.


تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) | التكنولوجيا الحيوية

تقدم المقالة المذكورة أدناه دليل المبتدئين لتفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). بعد قراءة هذا المقال سوف تتعرف على: 1. تاريخ PCR 2. مبدأ تفاعل البلمرة المتسلسل 3. متطلبات PCR 4. دورة تفاعل PCR 5. تحليل منتجات PCR 6. التطبيقات 7. الاحتياطات والعيوب 8. التعديلات.

  1. تاريخ PCR
  2. مبدأ تفاعل البلمرة المتسلسل
  3. متطلبات PCR
  4. دورة تفاعل PCR
  5. تحليل منتجات PCR
  6. تطبيقات PCR
  7. الاحتياطات والعيوب
  8. التعديلات

1. تاريخ PCR:

تعود فكرة PCR إلى Kary-Mullis الذي كان عالم أبحاث في 1980s في شركة Cali & shyfornia للتكنولوجيا الحيوية تسمى Cetus. أظهر موليس وخمسة باحثين آخرين في قسم الوراثة البشرية في Cetus أنه يمكن استخدام بادئات قليلة النوكليوتيد لتضخيم مقاطع محددة من DNA ge & shynomic (أو cDNA). فاز موليس بجائزة نوبل في الكيمياء عام 1993.

2. مبدأ تفاعل البلمرة المتسلسل:

تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) عبارة عن تضخيم إنزيمي تمهيدي بوساطة لتسلسلات الحمض النووي الجيني المحدد والمستنسخة بطريقة غير منتظمة. في هذه العملية ، نأخذ الحمض النووي مع الخجل المستهدف الذي نريد تضخيمه ، ونفسد طبيعته عن طريق زيادة درجة الحرارة ثم استخدام تمهيدي محدد للتسلسل لتضخيم تسلسل هدفنا بمساعدة بوليميراز DNA الموجود في جدول الشيموس.

في هذه التقنية نحاول إعادة إنتاج بيئة اصطناعية في ظل ظروف المختبر حيث يخضع تسلسل الحمض النووي المستهدف لجولات متعددة من دورة النسخ المتماثل لإنتاج شرطي وخجول هائلين من الجين المستهدف.

تتكون عملية PCR من ثلاث خطوات أساسية:

الخطوة 1:

تمسخ قالب الحمض النووي مزدوج الشريطة عن طريق زيادة درجة الحرارة و shyture إلى 94 & # 8211 98 درجة مئوية لمدة 30 ثانية لمدة 2 ميل و shynutes.

الخطوة 2:

تصلب اثنين من البادئات قليلة النوكليوتيد إلى درجة الحرارة أحادية السلسلة والصفائح عن طريق خفض درجة الحرارة إلى 50 - 65 درجة مئوية.

الخطوه 3:

التمديد الأنزيمي للبادئات لإنتاج نسخ يمكن أن تكون بمثابة مؤقت وألواح خشبية في الدورات اللاحقة.

3. متطلبات PCR:

(أ) قالب DNA:

يسمى جزيء الحمض النووي الأصلي الذي سيتم نسخه بقالب الحمض النووي ، ويعرف الجزء الذي سيتم تضخيمه بالفعل باسم تسلسل القطران والخجول. كمية التتبع لقالب الحمض النووي كافية. يمكن الحصول على هذا من خلال أي من تقنيات عزل الحمض النووي التي تمت مناقشتها من قبل.

(ب) بادئات PCR:

هناك حاجة إلى اثنين من البادئات PCR لبدء تخليق الحمض النووي. هذه قطع قصيرة من الحمض النووي أحادي الجديلة تتطابق مع التسلسلات في أي من طرفي مقطع الحمض النووي المستهدف. تصنع بادئات تفاعل البوليميراز المتسلسل بواسطة التوليف الكيميائي للحمض النووي.

هناك العديد من برامج الكمبيوتر المتاحة لاقتراح مواد أولية مناسبة لعملية تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) ، ويتم سرد بعض الإرشادات العامة والإرشادات أدناه:

تميل البادئات الأقصر إلى الانتقال والصلب إلى التسلسل غير المستهدف لقالب الحمض النووي. سيؤدي ذلك إلى إنتاج نسخ DNA ذات تسلسل غير مستهدف. كلما زاد تعقيد قالب الحمض النووي ، زاد احتمال حدوث ذلك.

وبالتالي ، قد يوفر التمهيدي القصير خصوصية كافية عند التضخيم باستخدام قالب بسيط مثل البلازميد الصغير ، ولكن يمكن إعادة التمهيدي الطويل والتخفيض عند استخدام الحمض النووي الجيني حقيقيات النوى كقالب. في الممارسة العملية ، 20-30 نيوكليوتيدات مرضية بشكل عام.

لا تحتاج البادئات إلى مطابقة القالب تمامًا ، على الرغم من أن الطرف 3 & # 8242 من التمهيدي يجب أن يقترن بشكل صحيح بالقالب ، وإلا فلن يتمكن البوليميراز من تمديده. غالبًا ما يكون من المفيد أن يكون لديك C أو G مثل النوكليوتيد الطرفي 3 & # 8242. هذا يجعل ربط الطرف 3 & # 8242 من التمهيدي مع tem & shyplate أكثر ثباتًا مما سيكون عليه مع A أو T في 3 & # 8242 النهاية.

3. درجة حرارة الانصهار:

يجب أن تكون درجات الحرارة التي يمكن أن يقترن عندها البادئون مع القالب متشابهة ومتناسقة لضمان ارتباط كلاهما في نفس الوقت تقريبًا حيث تنخفض درجات الحرارة وتنخفض أثناء التلدين. من المحتمل أن يعني التشابه بين درجات حرارة الانصهار أن البادئات لها تركيبة نيوكليوتيدية مماثلة.

4. الهيكل الثانوي الداخلي:

يجب تجنب ذلك لمنع التمهيدي من الانثناء مرة أخرى على نفسه وعدم الاستفادة منه وقابليته للارتباط بالقالب.

5. التلدين التمهيدي التمهيدي:

من المهم أيضًا تجنب قدرة البادئين على التصلب مع بعضهما البعض. يؤدي التمديد بواسطة بوليميراز الحمض النووي لاثنين من المواد الأولية الصلبة والخجول إلى تكوين ثنائي التمهيدي.

(ج) بوليميراز الحمض النووي المستقر حرارياً:

إن إنزيم DNA polymerase ضروري لتصنيع نسخ DNA. كان جزء Klenow هو أول إنزيم بوليميريز DNA يستخدم في تفاعل البوليميراز المتسلسل. شظية Klenow هي جزء كبير من البروتين ينتج عندما ينقسم DNA polymerase I من E. coli بواسطة الإنزيم البروتيني subtilisin.

بعد التعديل الأنزيمي ، فإنه يحتفظ بنشاط البوليميراز 5 & # 8242-3 & # 8242 ونشاط نوكلياز خارجي 3 & # 8242 → 5 & # 8242 لإعادة إزالة النيوكليوتيدات المشفرة مسبقًا وإثباتها وتخجلها ، ولكنه يفقد نشاطه 5 & # 8242 → 3 & # 8242.

فشل جزء Klenow في لعب دور ناجح باعتباره إنزيم بوليميراز لافتقاره إلى الاستقرار عند درجة حرارة عالية. كما نعلم أن إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) يتضمن عدة خطوات لدرجة الحرارة ، في هذا الموقع والأمر كان علينا تجديد جزء Klenow والخجل خلال كل دورة.

لحل هذه المشكلة ، كانت هناك حاجة إلى بوليميراز الحمض النووي المقاوم للحرارة. جاء هذا في الأصل من البكتيريا المقاومة للحرارة التي تعيش في الينابيع الساخنة عند درجات حرارة تصل إلى 90 درجة مئوية. اليوم Taq poly & shymerase من Thermusaquaticus هو أكثر إنزيم بوليميريز DNA PCR استخدامًا. يتم إنتاجه بشكل عام عن طريق expres & shysion من الجين في E. coli.

تساعد القوة الحرارية وخجل إنزيم Taq في Puri & shyfection بعد التعبير في E. coli ، حيث يمكن تلوث بروتينات E. coli ويمكن أن تتأثر بالتسخين. يحتوي الإنزيم على 5 & # 8242-3 & # 8242 بوليميريز DNA و 5 & # 8242-3 & # 8242 أنشطة نوكلياز خارجية. سوف تتبلمر حوالي 50-60 نيوكليوتيد في الثانية. ومع ذلك ، فإن en & shyzyme له عدد من الخصائص التي قد تكون غير مواتية.

1. لا يحتوي Taq Polymerase على دليل على القراءة (3 & # 8242-5 & # 8242 نوكلياز خارجي) النشاط:

وبالتالي فإن حوالي نيوكليوتيد واحد في 10 4 in & shycorporated غير صحيح ، وستكون المنتجات الفردية وخيوط تفاعل البوليميراز المتسلسل مجموعة غير متجانسة من السكان.

2. يتميز Taq Polymerase بإنتاجية منخفضة نسبيًا:

هذا يعني أنه من المحتمل أن ينفصل عن القالب قبل أن يصنع قطعة طويلة من الحمض النووي.

3. Taq Polymerase ليس مستقرًا تمامًا للحرارة:

يبلغ عمر النصف حوالي 40 دقيقة عند 95 درجة مئوية ، مما يعني أنه سيكون هناك خسارة كبيرة في النشاط على مدار 30 دورة أو نحو ذلك المستخدمة في تجربة PCR نموذجية. لذلك ، قد يكون من الضروري إضافة المزيد من الإنزيم خلال فترة سابقة وخجل.

4. يتضمن Taq Polymerase Ex & shytra a Residue:

تم دمج هذا في الطرف 3 & # 8242 من الخلد & shycule المركب ، ولم يتم ترميزه في القالب. يتوفر عدد من polymerases من أنواع أخرى من Thermus. وتشمل هذه إنزيمات Tfl و Tth من Thermusflavus و Thermusthermophilus على التوالي.

لا تحتوي هذه بشكل عام على 3 & # 8242-5 & # 8242 دليل القراءة ac & shytivity. تتوفر البوليميرات أيضًا من أجناس أخرى من البكتيريا (بما في ذلك البكتيريا البدائية) ، والعديد من هذه الإنزيمات لديها 3 & # 8242-5 & # 8242 نشاط تدقيق للقراءة (مما يعني أيضًا أنها لا تضيف عادة نيوكليوتيدات نهائية غير موجهة بالقوالب).

تشمل en & shyzymes إثبات القراءة Tli من Thermococcuslitoraiis و Pfu من Pyrococcusfuriosus. تنمو هذه البكتيريا البحرية بشكل عام في درجات حرارة أعلى من Thermusaquaticus ، وتكون البوليمرات أكثر استقرارًا وأكثر استقرارًا من إنزيم Taq.

(د) Deoxy Nucleotide Triphosphates:

يحتاج البوليميراز إلى إمداد أربعة ديوكسينوكليوتيد ثلاثي و shyphates و dATP و dCTP و dGTP و dTTP لصنع الحمض النووي الجديد.

(هـ) آلة PCR:

أخيرًا ، نحتاج إلى جهاز PCR للاستمرار في تغيير درجة الحرارة والغطاء. تتطلب عملية تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) ركوب الدراجات عبر درجات حرارة مختلفة. لهذا السبب ، تسمى آلات تفاعل البوليميراز المتسلسل أحيانًا بالدورات الحرارية.

4. دورة تفاعل PCR:

إن تفاعل البوليميراز المتسلسل هو تفاعل تسلسلي لأن خيوط الدنا المركبة حديثًا ستعمل كقالب لمزيد من تخليق الحمض النووي في الدورة اللاحقة. بعد 25 دورة من تخليق الحمض النووي ، ستشمل منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) ، بالإضافة إلى DNA البداية والخدش ، حوالي 10 5 نسخ من تسلسل القطران والخجول المحدد.

يتكون تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) من سلسلة من الدورات من ثلاث تفاعلات متتالية:

خطوة تمسخ:

هذه الخطوة هي أول حدث دوري منتظم وتتكون من تسخين التفاعل إلى 94-98 درجة مئوية لمدة 20-30 ثانية. يتسبب في ذوبان قالب الحمض النووي عن طريق تعطيل الروابط الهيدروجينية بين القواعد التكميلية ، مما ينتج عنه جزيئات DNA أحادية السلسلة.

خطوة التلدين:

يتم خفض درجة حرارة التفاعل والغطاء إلى 50-65 درجة مئوية لمدة 20-40 ثانية مما يسمح بتليين البادئات إلى قالب الحمض النووي المفرد الذي تقطعت به السبل. عادةً ما تكون درجة الحرارة الصلبة والخجولة حوالي 3-5 درجات مئوية تحت T.م من الاشعال المستخدمة.

تم يمكن تحديدها تجريبياً أو الحساب من الصيغة التالية:

تيم = (4 × [G + C]) + (2 × [A + T]) درجة مئوية

تتشكل روابط الهيدروجين DNA-DNA المستقرة فقط عندما يتطابق التسلسل التمهيدي مع تسلسل القالب بشكل وثيق. يرتبط البولي والشميريز بالهجين التمهيدي ويبدأ في تخليق الحمض النووي.

خطوة التمديد / الاستطالة:

تعتمد درجة الحرارة والضغط في هذه الخطوة على DNA poly & shymerase المستخدم. يحتوي Taq polymerase على درجة حرارة نشاطه Opti & shymum عند 75-80 درجة مئوية ، وعادة ما يتم استخدام درجة حرارة 72 درجة مئوية مع هذا الإنزيم. في هذه الخطوة ، يقوم بوليميراز الحمض النووي بتركيب خيط DNA جديد مكمل لقالب قالب الحمض النووي عن طريق إضافة dNTPs المكملة للقالب في اتجاه 5 & # 8242 إلى 3 & # 8242.

يعتمد وقت التمديد على بوليميريز الحمض النووي المستخدم وعلى طول جزء الحمض النووي المراد تضخيمه. كقاعدة عامة ، عند درجة الحرارة المثلى ، يقوم بوليميراز الحمض النووي بلمرة ألف قاعدة في الدقيقة.

في ظل الظروف المثلى ، على سبيل المثال ، إذا لم تكن هناك قيود بسبب تقييد الركائز أو الكواشف ، في كل خطوة تمديد ، تتم مضاعفة كمية هدف الحمض النووي ، مما يؤدي إلى تضخيم أسي (هندسي) لجزء الحمض النووي المحدد.

على سبيل المثال ، إذا بدأ المرء بجزيء DNA مزدوج الشريطة ، فبعد 20 دورة ، يصبح عدد جزيئات جزيء الحمض النووي المركب بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل 1 & # 21510 6 ، وبعد 30 دورة ، يزداد عدد جزيئات الحمض النووي والجزيئات إلى 1 & # 21510 9.

يمكن حساب هذا الرقم بمساعدة الصيغة التالية:

أين مF هو العدد النهائي من جزيئات الحمض النووي والجزيئات التي تنتجها PCR، MF هي الكمية الأولية لجزيئات الحمض النووي ، و n هي عدد دورات تفاعل البوليميراز المتسلسل.

استطالة نهائية:

يتم تنفيذ هذه الخطوة المفردة في درجة حرارة 70-74 درجة مئوية لمدة 5-15 دقيقة بعد آخر دورة تفاعل البوليميراز المتسلسل لضمان تمديد أي DNA متبقي أحادي الجديلة بالكامل.

5. تحليل منتجات PCR:

غالبًا ما يستخدم تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) كتقنية للحصول على معلومات وتسلسل حول قالب الحمض النووي الذي يحمل تسلسلًا مستهدفًا محددًا. تعتمد إعادة البحث عن التكنولوجيا الحيوية على نطاق واسع على تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) في مواقف مختلفة. ومن ثم هناك عدة طرق لتحليل نواتج تفاعل البوليميراز المتسلسل.

اتباع ثلاث تقنيات مهمة:

(أ) الرحلان الكهربائي الهلامي لمنتجات PCR:

تم تأكيد النتائج النهائية لمعظم تجارب تفاعل البوليميراز المتسلسل بإخضاع جزء من خليط التفاعل المتضخم إلى الاغاروز الكهربائي للهلام. هذا يمكن أن يخبرنا بصحة تجربة PCR. في حالة عدم وجود النطاق السابق والخطي أثناء تصور الهلام ، أو في حالة وجود نطاقات إضافية ، فقد حدث خطأ ما ويجب تكرار التجربة والخجل.

في بعض الحالات ، يستخدم الاغاروز الكهربائي للهلام ليس فقط لتحديد ما إذا كانت تجربة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) قد نجحت ، ولكن أيضًا للحصول على معلومات إضافية. يمكننا أيضًا تحديد وجود موقع التقييد في الحمض النووي للقالب عن طريق إخضاع منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل إلى نوكلياز داخلي لإعادة التضييق والتضييق قبل الرحلان الكهربائي والكهربائي.

هذا البروتوكول هو نوع من تحليل تعدد الأشكال (RFLP) الذي له أهمية كبيرة في بناء خرائط الجينوم ودراسة الأمراض الوراثية. يمكن أن يساعدنا التحليل الكهربي لمنتج تفاعل البوليميراز المتسلسل أيضًا في تحديد طفرة الإدراج أو التخلخل في المنطقة المضخمة.

(ب) استنساخ منتجات PCR:

أثناء تجربة الاستنساخ عدة مرات نأخذ مساعدة PCR مباشرة. إذا كان جين in & shyterest بكمية أقل ، فنحن بحاجة إلى تضخيمه. يتم ذلك بمساعدة PCR الذي ينتج نسخًا كافية من الحمض النووي المستهدف حتى نتمكن من بدء التجربة.

(ج) تسلسل منتجات PCR:

يتم إجراء عملية عزل منتج PCR بمساعدة جهاز التسلسل الآلي. ليست هناك حاجة للراديو- la & shybelling و autoradiography. هذه طريقة محجوبة وخجولة لتسلسل الحمض النووي بسبب سرعته ولأنه يمكن تحليله بواسطة الكمبيوتر بدلاً من شخص.

يحتوي PCR على عدد من التطبيقات خاصة عندما تكون السرعة وعدد العينات المراد معالجتها مهمين أو حيث تكون كمية الحمض النووي المتاحة محدودة للغاية. فيما يلي بعض التطبيقات.

أ. تسلسل الحمض النووي:

تفاعل البوليميراز المتسلسل في وجود ثنائي ديوكسينوكليوزيد ثلاثي الفوسفات (ddNTPs) ، المستخدم في تسلسل الحمض النووي ، تفاعلات تسلسل الحمض النووي مع كميات صغيرة جدًا من القالب.

ب. التشخيص:

يعتبر تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) مفيدًا كأداة تشخيصية ، على سبيل المثال ، في تحديد سمات وراثية معينة أو للكشف عن الممرضات والمسببات المرضية أو الملوثات الغذائية. من أولى تطبيقات تفاعل البوليميراز المتسلسل في التشخيص الجيني هو فقر الدم المنجلي.

ج. الطب الشرعي:

تؤدي القدرة على تضخيم الحمض النووي من مناطق الجينوم شديدة التعدد (والمتغيرة بين الأفراد) بدءًا من العينات التي تحتوي على كميات صغيرة جدًا من الحمض النووي (على سبيل المثال ، الشعيرات المفردة أو آثار سوائل الجسم ، مثل الدم والسائل المنوي) إلى تطبيقات وأعمال الطب الشرعي.

د. علم الوراثة السكانية في الوقت الحاضر:

إنه كذلك لتحديد ترددات أليلات معينة في مجموعة كبيرة من الأفراد. من المزايا الخاصة بنا والخجل من تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) في الدراسات الجينية السكانية أنه ، مع بادئات محددة مصممة بشكل مناسب ، قد يكون من الممكن تضخيم الحمض النووي من كائن حي لا يمكن فصله عن الآخرين ، مثل سلالة بكتيرية معينة في مجموعة سكانية مختلطة.

(ستصلب مثل هذه المواد الأولية إلى الحمض النووي المستهدف من الكائن الحي محل الاهتمام ، ولكن ليس من الحمض النووي من الآخرين.)

ه. علم الآثار والتطور:

يمكن استخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) مع المواد القديمة بالإضافة إلى المزيد من العينات المعاد تدويرها ، وغالبًا ما يكون من الممكن تضخيم الحمض النووي القديم من أنواع المتاحف والأغشية والبقايا الأثرية. في الغالب يتم استخدام DNA الميتوكوندريا أو DNA البلاستيدات الخضراء. هذا يسمح بإجراء استنتاجات حول أصول مجموعات أو أنواع معينة.

7. الاحتياطات والعيوب:

أنا. مقاس:

حجم الشظايا التي يمكن صقلها وتقسيمها مقيد بمعالجة البوليميراز المستخدم. يؤدي استخدام مزيج من البوليميراز الذي يحتوي على إنزيم مقاوم ومخجل إلى زيادة حجم pro & shyduct التي يمكن الحصول عليها (حتى 10 كيلو بايت أو أكثر) ، لأنه يمكن إزالة النيوكليوتيدات المدمجة بشكل غير صحيح بدلاً من التسبب في إنهاء السلسلة.

ثانيا. تضخيم التسلسل الخاطئ:

يعتمد PCR على قدرة البادئات على التصلب بالتسلسل الصحيح ، وهذا يعتمد على ظروف التلدين (التركيز الأيوني ، درجة الحرارة ، إلخ) والتسلسل الفعلي (أو المتواليات إذا تم تضمين المواقع المختلطة) من البادئات.

من الممكن أن تصلب البرايمر إلى & # 8220 خاطئ & # 8221 جزء من الحمض النووي المستهدف ، من خلال تكامل الصدفة. إذا حدث هذا وتصلب البرايمر في الاتجاه الصحيح والخجل لبعضهما البعض (أي ، توجيه التزامن والخجل تجاه بعضهما البعض) وفي مواقع ليست بعيدة جدًا ، فإن النتيجة هي تضخيم تسلسل آخر غير المطلوب.

يمكن تجنب احتمال التلدين غير الصحيح باستخدام مواد أولية أطول ، والتي ستكون أكثر تحديدًا في مواقع التلدين. يمكن استخدام رفع درجة الحرارة وضبط وتقليل تركيز أيونات المغنيسيوم (التي تعمل على استقرار ربط القالب التمهيدي) لزيادة خصوصية الربط التمهيدي.

ثالثا. تلوث اشعاعى:

بسبب الحساسية الخارجية والخطيرة لـ PCR ، هناك خطر متكافئ وملفوف من تلوث عينة الحمض النووي لتضخيمها بمواد دخيلة. هذا مهم بشكل خاص عند استخدام مادة تحتوي على كميات صغيرة فقط من الحمض النووي ، كما هو الحال مع الأعمال الأثرية.

قد يكون التلوث من أصل مختبر و shytory (على سبيل المثال ، من الهباء الجوي الذي تم إنشاؤه بواسطة محاليل الماصات التي تحتوي على تسلسلات الحمض النووي ذات الصلة ، بما في ذلك المواد التي تم تضخيمها سابقًا بواسطة PCR) أو من أصل خارجي وخجول (ربما عن طريق التلوث البكتيري أو الفطري أو البشري لأنسجة العينة).

يمكن أن يكون التلوث المختبري صغيرًا ومضغوطًا من خلال الاحتياطات مثل الاستخدام الدقيق وتصميم الماصات ، وفصل مراحل ما قبل تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) وما بعد تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) من التجربة والخجل إلى غرف مختلفة. يمكن تقليل التلوث من مصادر أخرى عن طريق العناية والتعامل الخجول مع العينة قبل التضخيم.

رابعا. عدم تجانس التسلسل:

قد يؤدي التضخيم إلى ظهور مزيج من الجزيئات ذات التسلسلات المختلفة قليلاً.

يمكن أن ينشأ خليط لعدة أسباب:

إذا جاء الحمض النووي للقالب من فرد متغاير الزيجوت في الموضع المعني ، فيجب تمثيل كل من الأليلات الموجودة بكميات مماثلة في نواتج وخطوات تفاعل البوليميراز المتسلسل.

(ب) عدم تجانس السكان:

إذا جاء DNA tem & shyplate من عدة أفراد وخجول بدلاً من فرد واحد ، فقد يؤدي التباين واللامبالاة في السكان إلى عدم التجانس في المنتجات.

(ج) تلف الحمض النووي وخطأ البوليميراز:

يمكن أن تنشأ عدم التجانس أيضًا من تلف الحمض النووي قبل التضخيم ، خاصةً إذا لم يتم حفظ العينة بعناية. لذلك ، من المحتمل بشكل خاص أن تكون هذه مشكلة مع المواد الأثرية والطب الشرعي.

V. قفز PCR:

عندما يتم تضخيم الحمض النووي المتحلل ، قد يكون أي جزيء عينة معين ليس طويلاً بما يكفي لتمتد على كامل المسافة بين موقعي التحضير. ستكون النتيجة في الجولة الأولى من syn & shythesis امتدادًا من التمهيدي إلى نهاية جزيء مجزأ ، ولكن ليس على طول الطريق إلى موقع التمهيدي الثاني.

كيف & خجول ، في جولة لاحقة من التوليف ، قد يصلب منتج التضخيم المقطوع إلى جزء مختلف من الحمض النووي الذي يحتوي على المنطقة المتبقية سليمة. سيسمح هذا بعد ذلك بتوليف منتج PCR الكامل. وهذا ما يسمى القفز PCR. لذلك من الممكن أحيانًا إنشاء منتجات PCR أطول من أي جزيء قالب مستقل و shyvidual. يمكن أن يكون هذا إعلانيًا وخجولًا عند تضخيم الحمض النووي السيئ التآكل.

8. التعديلات:

أ. Hot-Start PCR:

بمجرد أن يتم خلط كل من إعادة تكوين تفاعل البوليميراز المتسلسل ومخلفاته معًا ، فمن الممكن أن يبدأ بوليميريز الحمض النووي في التوليف. قد يحدث هذا أثناء تسخين خليط إعادة الخجل لأول مرة ، ويكون عند درجة حرارة منخفضة بما يكفي للسماح بالتلدين غير المحدد للبرايمر إلى القالب ، مما ينتج عنه مجموعة من المنتجات غير السريعة والغير محددة.

ستكون هذه المشكلة مسبقة الاختراق إذا لم يكن من الممكن حدوث تخليق الحمض النووي حتى تصل الدورة الأولى إلى درجة الحرارة القصوى. هذا هو أساس بدء تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). في أبسط أشكالها ، لا تتم إضافة بوليميراز الدنا إلى أنابيب التفاعل حتى تصل إلى درجة حرارة انصهار الحمض النووي للدورة الأولى. هذا مرضٍ حيث تتم معالجة أعداد صغيرة من العينات ، ولكن ليس بأعداد كبيرة.

ب. Touch-Down PCR:

إن درجة حرارة التلدين والشيخوخة المستخدمة في PCR التقليدي هي عادة وبخجل عدة درجات أقل من الحد الأقصى الذي يمكن أن تظل فيه البادئات مقيدة بالحرارة والصفيحة ، لضمان الربط المستقر. ومع ذلك ، فإن هذا الاستخدام لدرجة الحرارة المنخفضة يسمح بقدر ضئيل من عدم التطابق بين البادئات والقالب ، مما قد يسمح للطلاء التمهيدي بالارتباط بالمواقع غير الصحيحة وتوليد المنتجات الزائفة وإخفائها.

يمكن تقليل آثار ذلك عن طريق اللمس لأسفل PCR. في هذا ، يتم استخدام درجة حرارة التلدين العالية مبدئيًا (حيث قد لا يكون من الممكن حتى الربط الصحيح والخجل). يتم تقليل درجة حرارة التلدين في الجولات اللاحقة. وبالتالي ، ستأتي نقطة يكون فيها تلدين الطبقة الأولية المتوافقة بشكل صحيح أمرًا ممكنًا ، ولكن المطابقة غير الصحيحة والدمجة ليست كذلك ، وستكون النواتج والأدوات المرغوبة هي الأكثر وفرة.

ج. متداخلة PCR:

هنا ، يتم إجراء تقريري PCR متتاليين. يستخدم أول PCR نموذجًا خادعًا وخداعًا. ثم يتم استخدام منتجات أول PCR كقالب لـ PCR الثاني ، مع مواد أولية مصممة للتصلب داخل المنتج المطلوب من أول PCR.

على الرغم من أن تفاعل البوليميراز المتسلسل الأول قد ينتج بعض المنتجات غير المحددة بالإضافة إلى المنتجات المرغوبة ، فمن غير المحتمل أن تحتوي المنتجات غير المحددة أيضًا على مواقع التلدين لكل من البادئات المستخدمة في تفاعل البوليميراز المتسلسل الثاني. وبالتالي ، من المرجح أن تكون المنتجات المرغوبة من أول PCR قوالب مناسبة للثاني فقط.

د. معكوس PCR:

من الممكن ترتيب تضخيم التسلسلات خارج البادئات ، في تقنية تسمى معكوس PCR (IPCR). في هذه التقنية ، يتم قطع عينة الحمض النووي أولاً باستخدام إنزيم خارج المنطقة التي يكون تسلسلها معروفًا بالفعل.

يتم بعد ذلك تعميم الجزيئات الخطية الناتجة عن طريق الربط تحت ظروف و shytions تفضل التفاعلات بين الجزيئات. ثم يتم إجراء عملية هضم تقييد ثانية ، باستخدام قطع إنزيم داخل منطقة التسلسل المعروف.

والنتيجة الآن هي أن الجزء الأول الذي يحتوي على هذا التسلسل قد تم قلبه & # 8216 داخل الداخل & # 8217 ، تاركًا التسلسل المعروف من الخارج والمواد التي كانت تحيط به سابقًا. يمكن الآن استخدام مواد أولية مكملة للتسلسل المعروف على الجزء الخارجي من الخلد والكتلة لتضخيم منطقة الاهتمام بينهما.

ه. عكس Transcriptase PCR:

غالبًا ما يكون من الملائم تضخيم جزيئات الحمض النووي الريبي (RNA) ، ربما كخطوة تمهيدية لاستنساخها ، أو لتقدير وفرة mRNA معين في عينة. يتم ذلك عادةً عن طريق إجراء جولة من النسخ العكسي ، باستخدام إنزيم النسخ العكسي وبادئ واحد ، لعمل خيط واحد من cDNA قبل PCR نفسه.

يمكن أن يكون التمهيدي للنسخ العكسي هو oligo-dT لتخليق cDNA العام من الرسائل المتعددة الأدينيلات ، أو يمكن أن يكون خاصًا برسالة معينة.

F. في الموقع PCR:

من الممكن إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام الأنسجة المنفصلة ، مثل المقاطع الرقيقة على شريحة المجهر. يتطلب هذا جهاز PCR مكيفًا بشكل خاص لاستيعاب الشريحة. إذا كان من الممكن اكتشاف منتج PCR & shyuct (ربما عن طريق hybridiza & shytion ، أيضًا في الموقع) ، فهذا يسمح للشخص بتحديد مكان وجود الحمض النووي المستهدف في الأنسجة.

ز. PCR غير متماثل:

من خلال تقليل كمية أحد البادئين ، يكون من المناسب وغير المنطقي الترتيب للتضخيم التفضيلي والتقطيع لأحد الخيوط ، مما يؤدي إلى تحضير DNA أحادي السلسلة ، والذي له عدد من الاستخدامات في البيولوجيا الجزيئية. يُعرف التضخيم التفضيلي لشريط واحد بهذه الطريقة باسم تفاعل البوليميراز المتسلسل غير المتناظر والشديد.

ح. مثبت PCR:

يتم تطبيق PCR المثبت عند معرفة قطعة واحدة فقط من التسلسل (وبالتالي ، موقع فتيلة واحد) لمنطقة الاهتمام. الهدف هو إرفاق المنطقة المراد تضخيمها بقطعة من التسلسل المعروف ثم استخدامها كموقع تحضير ثانٍ.

هناك طريقتان يمكن من خلالهما القيام بذلك بسهولة. الأول هو تفتيت عينة الحمض النووي وربطها بجزيئات ذات تسلسل معروف ، مثل ناقل. يستخدم هذا التسلسل المعروف كأساس لتصميم واحد من اثنين من البادئات PCR. الطريقة الثانية هي إضافة ذيول بشكل إنزيمي إلى عينة الحمض النووي أو الجزيئات المنتجة بعد الجولة الأولى من التركيب.

أنا. مستحلب PCR:

في PCR التقليدي ، يتم إجراء التفاعلات داخل أنابيب بلاستيكية. من الممكن دمج جميع الكواشف داخل قطرات الدهون وتنفيذ تفاعل البوليميراز المتسلسل على نطاق أصغر بكثير. هذا له مزايا معينة. من الممكن زيادة درجة حرارة القطرات الصغيرة وتقليلها بسرعة كبيرة.

بالإضافة إلى ذلك ، إذا كانت كل قطرة تحتوي على جزيء قالب واحد في البداية ، فإن جميع المنتجات الموجودة في القطرة الفردية تنتج من am & shyplification لجزيء قالب واحد. وتسمى هذه الطريقة أيضًا بالقطيرة PCR.

ي. التضخيم متساوي الحرارة:

التسخين والتبريد المتكرر المطلوب بواسطة PCR lim & shyits مدى السرعة التي يمكن بها تنفيذ العملية. تم تطوير تضخيم وتضخيم متساوي الحرارة بوساطة حلقة (LAMP) ، مما يسمح بتضخيم القوالب عند درجة حرارة ثابتة (عادة حوالي 65 درجة مئوية).

إنه يستخدم بوليميريز DNA مع نشاط إزاحة الخيوط ويتجنب الحاجة إلى التسخين لدرجات حرارة عالية. تستخدم هذه الطريقة للكشف عن مسببات الأمراض خارج المختبرات المتخصصة.

ك. الوقت الحقيقي PCR:

من الممكن استخدام PCR لتقدير وفرة جزيء حمض نووي معين في عينة. يمكن القيام بذلك عن طريق PCR في الوقت الحقيقي. ويمكن أن يتم ذلك بطريقتين.

في الأول ، توجد صبغة ملزمة للحمض النووي الفلوري ، مزدوج السلسلة (dsDNA) (مثل SYBR الأخضر) في تفاعل البوليميراز المتسلسل. عندما يتراكم منتج dsDNA و shyuct ، تزداد كمية التألق من الصبغة ، ويمكن تفكيك ذلك وإزالته.

تتطلب التجربة جهاز PCR و shychine مجهزًا أيضًا بمرفق قياس التألق. نظرًا لأن الطريقة تكتشف ببساطة dsDNA ، فإنها تقيس كمية منتج PCR في وقت معين بغض النظر عما إذا كان من المنطقة الصحيحة.

الطريقة الثانية لاكتشاف PCR al & shylows في الوقت الفعلي لمنتج معين ، بدلاً من dsDNA بشكل عام ، ويستخدم بشكل خاص oligonucleotide مسبار متزامن ومختجل. تم تصميم هذا المسبار ليحلل داخل المنطقة المراد تضخيمها ويحمل صبغة مراسل الفلورسنت في أحد طرفيه ومخمد في الطرف الآخر من الجزيء.

إذا كان المبرد والمراسل قريبين من بعضهما البعض (على سبيل المثال ، مرتبطان بنفس قليل النوكليوتيد) ، فإن المخمد يوقف المراسل عن التألق.

أثناء تفاعل البوليميراز المتسلسل ، سيصلب المسبار إلى DNA أحادي الجديلة داخل المنطقة المستهدفة. عندما يلتقي poly & shymerase بالمسبار الملدن ، فإن نشاط الإنزيم الخارجي 5 & # 8242-3 & # 8242 يحط من المسبار ، مما يحرر المراسل من المخمد. وبالتالي ، فإن المراسل الفلوري يتكيف ويتراكم أثناء PCR. يظهر هذا النوع من آلية تفاعل البوليميراز المتسلسل في dia & shygram الموضح أعلاه.


سؤال : PCR أدناه ، ترى: الشكل أ: تسلسل الحمض النووي (800 نانومتر من أول ATG إلى آخر TAA) مع مواضع مواقع أنزيمات التقييد الشكل ب: مواقع الاستنساخ المتعددة (MCS) للحمض النووي البلازميدي ، والشكل ج: أنشطة إنزيمات التقييد المدرجة في ثلاثة مخازن مشتركة. المهمة: ستحتاج إلى إيجاد إستراتيجية لتقديم منطقة الترميز الخاصة بـ

الشكل ج: أنشطة إنزيمات التقييد المدرجة في ثلاثة مخازن مشتركة.

المهمة: سوف تحتاج إلى إيجاد استراتيجية لإدخال منطقة تشفير الجين (من أول ATG إلى آخر TAA) في مواقع الاستنساخ المتعددة (MCS) للناقل باستخدام تقنيات PCR والاستنساخ الجزيئي.

لهذه المهمة سوف تحتاج:

(المهمة 1) لاختيار اثنين من إنزيمات التقييد في MCS لإدخال الحمض النووي الخاص بك (5 علامات)

(المهمة 2) لتصميم بادئات PCR للأمام والعكس ، والتي تحتوي على تسلسل مواقع التقييد المحددة (10 علامات لكل أساس = إجمالي 20 علامة)

(المهمة 3) احسب Tm لكلا البادرين (5 علامات لكل منهما ، إجمالي 10 علامات).


الطفرات موقع الموجه

الطفرات الموجهة بالموقع (SDM) هي طريقة لإنشاء تغييرات محددة وموجهة في DNA البلازميد المزدوج الذي تقطعت به السبل. هناك العديد من الأسباب لإجراء تعديلات معينة في الحمض النووي (عمليات الإدراج والحذف والاستبدال) ، بما في ذلك:

  • لدراسة التغيرات في نشاط البروتين التي تحدث نتيجة التلاعب بالحمض النووي.
  • لتحديد أو فحص الطفرات (على مستوى الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي أو البروتين) التي لها خاصية مرغوبة
  • لإدخال أو إزالة مواقع نوكلياز أو علامات تقييد


نظرة عامة على الطريقة:

SDM هو ملف في المختبر الإجراء الذي يستخدم بادئات قليلة النوكليوتيد مصممة خصيصًا لمنح الطفرة المرغوبة في بلازميد DNA مزدوج الشريطة. في السابق ، كانت طريقة ابتكرها Kunkel (Kunkel ، 1985) تستفيد من سلالة ناقصة في dUTPase و uracil deglycosylase بحيث المتلقي بكتريا قولونية يحط من الحمض النووي الذي يحتوي على اليوراسيل وكان يستخدم على نطاق واسع. يوجد حاليًا عدد من الأطقم المتاحة تجاريًا والتي تتطلب أيضًا تعديلًا محددًا و / أو فريدًا بكتريا قولونية سلالات (على سبيل المثال ، الطفرات & reg من Thermo ونظام GeneArt & reg من Life). لا تتطلب الطرق الأكثر استخدامًا أي تعديلات أو سلالات فريدة ودمج الطفرات في البلازميد عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي مع البادئات القياسية. For these methods, primers can be designed in either an overlapping (QuikChange ® , Agilent) or a back-to-back orientation (Q5 ® Site-Directed Mutagenesis Kit) (Figure 1). Overlapping primer design results in a product that will re-circularize to form a doubly-nicked plasmid. Despite the presence of these nicks, this circular product can be directly transformed into بكتريا قولونية, albeit at a lower efficiency than non-nicked plasmids. Back-to-back primer design methods not only have the advantage of transforming non-nicked plasmids, but also allow exponential amplification to generate significantly more of the desired product (Figure 2). In addition, because the primers do not overlap each other, deletions sizes are only limited by the plasmid and insertions are only limited by the constraints of modern primer synthesis. Currently, by splitting the insertion between the two primers, insertions up to 100 bp can routinely be created in one step using this method.

Before primers are designed, it is important to determine which mutagenesis workflow is to be used. Here we present a comparison of three commercially available kits (Figure 3) and a brief description of important features.

Before you plan your next SDM experiment, be sure to read through our list of important experimental considerations.

Figure 1: Site-specific mutagenesis proceeds in less than 2 hours

The use of a master mix, a unique multi-enzyme KLD enzyme mix, and a fast polymerase ensures that, for most plasmids, the mutagenesis reaction is complete in less than two hours.

Figure 2: Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit Overview

This kit is designed for rapid and efficient incorporation of insertions, deletions and substitutions into doublestranded plasmid DNA. The first step is an exponential amplification using standard primers and a master mix fomulation of Q5 Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase. The second step involves incubation with a unique enzyme mix containing a kinase, a ligase and DpnI. Together, these enzymes allow for rapid circularization of the PCR product and removal of the template DNA. The last step is a high-efficiency transformation into chemicallycompetent cells (provided).

Figure 3: Primer Design for the Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit

Substitutions, deletions and insertions are incorporated into plasmid DNA through the use of specifically designed forward (black) and reverse (red) primers. Unlike kits that rely on linear amplification, primers designed for the Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit should not overlap to ensure that the benefits of exponential amplification are realized. A) Substitutions are created by incorporating the desired nucleotide change(s) (denoted by *) in the center of the forward primer, including at least 10 complementary nucleotides on the 3´side of the mutation(s). The reverse primer is designed so that the 5´ ends of the two primers anneal back-to- back. B) Deletions are engineered by designing standard, non-mutagenic forward and reverse primers that flank the region to be deleted. C) Insertions less than or equal to 6 nucleotides are incorporated into the 5´ end of the forward primer while the reverse primer anneals back-to-back with the 5´ end of the complementary region of the forward primer. D) Larger insertions can be created by incorporating half of the desired insertion into the 5´ ends of both primers. The maximum size of the insertion is largely dictated by oligonucleotide synthesis limitations.

Cloning-free template DNA preparation for cell-free protein synthesis via two-step PCR using versatile primer designs with short 3'-UTR

Cell-free protein synthesis (CFPS) systems largely retain the endogenous translation machinery of the host organism, making them highly applicable for proteomics analysis of diverse biological processes. However, laborious and time-consuming cloning procedures hinder progress with CFPS systems. Herein, we report the development of a rapid and efficient two-step polymerase chain reaction (PCR) method to prepare linear DNA templates for a wheat germ CFPS system. We developed a novel, effective short 3'-untranslated region (3'-UTR) sequence that facilitates translation. Application of the short 3'-UTR to two-step PCR enabled the generation of various transcription templates from the same plasmid, including fusion proteins with N- or C-terminal tags, and truncated proteins. Our method supports the cloning-free expression of target proteins using an mRNA pool from biological material. The established system is a highly versatile platform for in vitro protein synthesis using wheat germ CFPS.

الكلمات الدالة: 3′-UTR cell-free protein synthesis wheat germ extract.

© 2017 Molecular Biology Society of Japan and John Wiley & Sons Australia, Ltd.


Colony PCR

Colony PCR is a convenient high-throughput method for determining the presence or absence of insert DNA in plasmid constructs. Individual transformants can either be lysed in water with a short heating step or added directly to the PCR reaction and lysed during the initial heating step. This initial heating step causes the release of the plasmid DNA from the cell, so it can serve as template for the amplification reaction. Primers designed to specifically target the insert DNA can be used to determine if the construct contains the DNA fragment of interest. Alternatively, primers targeting vector DNA flanking the insert can be used to determine whether or not the insert is the correct molecular size. Insert specific primers can provide information on both the specificity and size of the insert DNA while the use of vector specific primers allows screening of multiple constructs simultaneously. Colony PCR can also be used to determine insert orientation. PCR amplification of the plasmid using an insert specific primer paired with a vector specific primer can be designed to produce an amplicon of a specific size only if the insert is in the correct orientation. In all experimental designs, presence or absence of a PCR amplicon and size of the product are determined by electrophoresis alongside a DNA size marker on an agarose gel.

Choose Type:

Feature Articles

Brochures

أدوات الويب

Troubleshooting Guides

Usage Guidelines

هذا المنتج مغطى بواحدة أو أكثر من براءات الاختراع والعلامات التجارية و / أو حقوق النشر المملوكة أو الخاضعة لسيطرة New England Biolabs، Inc (NEB).

بينما تقوم NEB بتطوير منتجاتها والتحقق منها لتطبيقات مختلفة ، فإن استخدام هذا المنتج قد يتطلب من المشتري الحصول على حقوق ملكية فكرية إضافية لطرف ثالث لتطبيقات معينة.

لمزيد من المعلومات حول الحقوق التجارية ، يرجى الاتصال بفريق تطوير الأعمال العالمية في NEB على [email protected]

هذا المنتج مخصص لأغراض البحث فقط. هذا المنتج غير مخصص للاستخدام لأغراض علاجية أو تشخيصية في البشر أو الحيوانات.


استنساخ

The gene of interest usually has to be amplified from genomic or vector DNA by PCR (polymerase chain reaction) before it can be cloned into an expression vector. The first step is the design of the necessary primers.

Primer sequence. Especially the 3'-end of the primer molecule is critical for the specificity and sensitivity of PCR. It is recommended not to have:

  • 3 of more جي أو ج bases at this position. This may stabilize nonspecific annealing of the primer.
  • a 3' thymidine, since it is more prone to mispriming than the other nucleotides.

Primer pairs should be checked for complementarity at the 3'-end. This often leads to primer-dimer formation.

Bases at the 5'-end of the primer are less critical for primer annealing. Therefore, it is المستطاع to add sequence elements, like restriction sites, to the 5'-end of the primer molecule.

Primer length. Usually a primer length of 18-30 bases is optimal for most PCR applications. Shorter primers could lead to amplification of nonspecific PCR products.

Melting temperature (Tم). ال النوعية of PCR depends strongly on the melting temperature (Tم) of the primers (the temperature at which half of the primer has annealed to the template). Usually good results are obtained when the Tم's for both primers are similar (within 2-4 °C) and above 60°C. The Tم for a primer can be estimated using the following formula:

GC content. The GC content of a primer should be between 40 و 60%.

Design of the 5'-end primer

The 5'-end primer overlaps with the 5'-end of the gene of interest and should contain the following elements:

  • Restriction site. The restriction site should be the same or provide the same sticky end to the first of the restriction enzymes in the multiple cloning site of the vector chosen to clone the gene of interest into. Alternatively, you could pick any restriction enzyme that gives a blunt end upon cleavage (see cloning). غالبا Nco ICCATGG) or Nde I (CATATG) are chosen because the ATG within these sites can be used directly to create the ATG start codon and/or the ATG codon for the N-terminal methionine residue (see Utilisation of the Nco I cloning site)
  • 5'-extension to the restriction site. Restriction enzymes cleave DNA much less efficient towards the end of a fragment. A 5' extension of the restriction site with 2-10 bases greatly increases the cleavage efficiency of most enzymes. Data on the effect of the extension length and sequence on the cleavage efficiencies of the most used restriction enzymes can be found in the reference appendix of the New England Biolabs catalogue.
  • Start codon. A start codon (usually ATG) should be included when the gene of interest is not expressed with an N-terminal tag or fusion partner or when an N-terminal methionine residue is present. It should be checked that the start codon and the gene of interest are in frame with an eventual N-terminal tag and/or fusion partner.
  • Overlap with the gene of interest. The overlap between the primer and the gene of interest should be long enough to give a Tم of 60°C or more (calculated as shown above).

8 Approaches to Random Mutagenesis

Random mutagenesis is an incredibly powerful tool for altering the properties of enzymes. Imagine, for example, you were studying a G-protein coupled receptor (GPCR) and wanted to create a temperature-sensitive version of the receptor or one that was activated by a different ligand than the wild-type. How could you do this?

Firstly, you would clone the gene encoding the receptor, then randomly introduce mutations into the gene sequence to create a “library” containing thousands of versions of the gene. Each version (or “variant”) of the gene in the library would contain different mutations and so encode receptors with slightly altered amino acid sequences giving them slightly different enzymatic properties than the wild-type.

Next, you could transform the library into a strain where the receptor would be expressed and apply a high throughput screen to pick out variants in the library that have the properties you are looking for. Using a high throughput screen for GPCR activity (see here for examples) you could pick out the variants from the library that were temperature-sensitive or were activated by different ligands.

Sound easy? Well, of course it’s not that easy. Creating a random mutant library that contains enough variants to give you a good chance of obtaining the altered enzyme you desire is a challenge in itself. There are many ways to create random mutant libraries, each with it’s own pros and cons. Here are some of them:

1. Error-prone PCR. This approach uses a “sloppy” version of PCR, in which the polymerase has a fairly high error rate (up to 2%), to amplify the wild-type sequence. The PCR can be made error-prone in various ways including increasing the MgCl2 in the reaction, adding MnCl2 or using unequal concentrations of each nucleotide. Here is a good review of error prone PCR techiques and theory. After amplification, the library of mutant coding sequences must be cloned into a suitable plasmid. The drawback of this approach is that size of the library is limited by the efficiency of the cloning step. Although point mutations are the most common types of mutation in error prone PCR, deletions and frameshift mutations are also possible. There are a number of commercial error-prone PCR kits available, including those from Stratagene and Clontech.

2. Rolling circle error-prone PCR is a variant of error-prone PCR in which wild-type sequence is first cloned into a plasmid, then the whole plasmid is amplified under error-prone conditions. This eliminates the ligation step that limits library size in conventional error-prone PCR but of course the amplification of the whole plasmid is less efficient than amplifying the coding sequence alone. More details can be found here.

3. Mutator strains. In this approach the wild-type sequence is cloned into a plasmid and transformed into a mutator strain, such as Stratagene’s XL1-Red. XL1-red is an E.coli strain whose deficiency in three of the primary DNA repair pathways (mutS, mutD و mutT) causes it to make errors during replicate of it’s DNA, including the cloned plasmid. As a result each copy of the plasmid replicated in this strain has the potential to be different from the wild-type. One advantage of mutator strains is that a wide variety of mutations can be incorporated including substitutions, deletions and frame-shifts. The drawback with this method is that the strain becomes progressively sick as it accumulates more and more mutations in it’s own genome so several steps of growth, plasmid isolation, transformation and re-growth are normally required to obtain a meaningful library.

4. Temporary mutator strains. Temporary mutator strains can be built by over-expressing a mutator allele such as mutD5 (a dominant negative version of mutD) which limits the cell’s ability to repair DNA lesions. By expressing mutD5 from an inducible promoter it is possible to allow the cells to cycle between mutagenic (mutD5 expression on) and normal (mutD5 expression off) periods of growth. The periods of normal growth allow the cells to recover from the mutagenesis, which allows these strains to grow for longer than conventional mutator strains.

If a plasmid with a temperature-sensitive origin of replication is used, the mutagenic plasmid can easily be removed restore normal DNA repair, allowing the mutants to be grown up for analysis/screening. An example of the construction and use of such a strain can be found here. As far as I am aware there are no commercially available temporary mutator strains.

5. Insertion mutagenesis. Finnzymes have a kit that uses a transposon-based system to randomly insert a 15-base pair sequence throughout a sequence of interest, be it an isolated insert or plasmid. This inserts 5 codons into the sequence, allowing any gene with an insertion to be expressed (i.e. no frame-shifts or stop codons are cause). Since the insertion is random, each copy of the sequence will have different insertions, thus creating a library.

6. Ethyl methanesulfonate (EMS) is a chemical mutagen. EMS aklylates guanidine residues, causing them to be incorrectly copied during DNA replication. Since EMS directly chemically modifies DNA, EMS mutagenesis can be carried out either in vivo (i.e. whole-cell mutagenesis) or in vitro. An example of in vitro mutagenesis with EMS in which a PCR-amplified gene was subjected to reaction with EMS before being ligated into a plasmid and transformed can be found here.

7. Nitrous acid is another chemical mutagen. It acts by de-aminating adenine and cytosine residues (although other mechanisms are discussed here) causing transversion point mutations (A/T to G/C and vice versa). An example of a study using nitrosoguanidine mutagenesis can be found here.

ملحوظة: I have only mentioned two chemical mutagens but there are many others. Hirokazu Inoue has written an excellent article describing some of them and their use in mutagenesis, see here (pdf).

Another note: Chemical mutagens are, of course… mutagens and therefore should be handled with great care. Be especially careful with EMS as it is volatile at room temperature. Read the MSDS and do a proper risk assessment before carrying out these experiments.


What are the Similarities Between Forward and Reverse Primer?

  • Both Forward and Reverse primers are made from oligonucleotides.
  • Both Forward and Reverse Primers possess short nucleotide sequence complementary to the flanking ends of the DNA double strands.
  • Both Forward and Reverse primers usually consist of 20 nucleotides.
  • Both Forward and Reverse Primers are used in polymerase chain reactions.
  • Both Forward and Reverse Primers are synthesized commercially.
  • Both Forward and Reverse primers are temperature stable and they are normally having similar Tm.
  • Both Forward and Reverse Primers are annealed with the target DNA sequences.
  • Both Forward and Reverse Primers are designed according to the PCR reactions.
  • Both Forward and Reverse Primers are served as starting points for the DNA amplification.
  • Both reverse and forward primers are important for the production of million copies of particular regions of targeted or interested DNA sequences.

Uses of PCR

PCR can be used for a broad variety of experiments and analyzes. Some examples are discussed below.

Genetic fingerprinting

Genetic fingerprinting is a forensic technique used to identify a person by comparing his or her DNA with a given sample, e.g., blood from a crime scene can be genetically compared to blood from a suspect. The sample may contain only a tiny amount of DNA, obtained from a source such as blood, semen, saliva, hair, etc. Theoretically, just a single strand is needed. First, one breaks the DNA sample into fragments, then amplifies them using PCR. The amplified fragments are then separated using gel electrophoresis. The overall layout of the DNA fragments is called a DNA fingerprint.

Paternity testing

Although these resulting 'fingerprints' are unique (except for identical twins), genetic relationships, for example, parent-child or siblings, can be determined from two or more genetic fingerprints, which can be used for paternity tests (Fig. 4). A variation of this technique can also be used to determine evolutionary relationships between organisms.

Detection of hereditary diseases

The detection of hereditary diseases in a given genome is a long and difficult process, which can be shortened significantly by using PCR. Each gene in question can easily be amplified through PCR by using the appropriate primers and then sequenced to detect mutations.

Viral diseases, too, can be detected using PCR through amplification of the viral DNA. This analysis is possible right after infection, which can be from several days to several months before actual symptoms occur. Such early diagnoses give physicians a significant lead in treatment.

Cloning genes

Cloning a gene--not to be confused with cloning a whole organism--describes the process of isolating a gene from one organism and then inserting it into another organism (now termed a genetically modified organism (GMO)). PCR is often used to amplify the gene, which can then be inserted into a vector (a المتجه is a piece of DNA which 'carries' the gene into the GEO) such as a plasmid (a circular DNA molecule) (Fig. 5). The DNA can then be transferred into an organism (the GMO) where the gene and its product can be studied more closely. Expressing a cloned gene (when a gene is expressed the gene product (usually protein or RNA) is produced by the GMO) can also be a way of mass-producing useful proteins--for example, medicines or enzymes in biological washing powders. The incorporation of an affinity tag on a recombinant protein will generate a fusion protein which can be more easily purified by affinity chromatography.

Mutagenesis

Mutagenesis is a way of making changes to the sequence of nucleotides in the DNA. There are situations in which one is interested in mutated (changed) copies of a given DNA strand, for example, when trying to assess the function of a gene or in in-vitro protein evolution. Mutations can be introduced into copied DNA sequences in two fundamentally different ways in the PCR process. الطفرات موقع الموجه allows the experimenter to introduce a mutation at a specific location on the DNA strand. Usually, the desired mutation is incorporated in the primers used for the PCR program. Random mutagenesis, on the other hand, is based on the use of error-prone polymerases in the PCR process. In the case of random mutagenesis, the location and nature of the mutations cannot be controlled. One application of random mutagenesis is to analyze structure-function relationships of a protein. By randomly altering a DNA sequence, one can compare the resulting protein with the original and determine the function of each part of the protein.

Analysis of ancient DNA

Using PCR, it becomes possible to analyze DNA that is thousands of years old. PCR techniques have been successfully used on animals, such as a forty-thousand-year-old mammoth, and also on human DNA, in applications ranging from the analysis of Egyptian mummies to the identification of a Russian tsar.

Genotyping of specific mutations

Through the use of allele-specific PCR, one can easily determine which allele of a mutation or polymorphism an individual has. Here, one of the two primers is common, and would anneal a short distance away from the mutation, while the other anneals right on the variation. The 3' end of the allele-specific primer is modified, to only anneal if it matches one of the alleles. If the mutation of interest is a T or C single nucleotide polymorphism (T/C SNP), one would use two reactions, one containing a primer ending in T, and the other ending in C. The common primer would be the same. Following PCR, these two sets of reactions would be run out on an agarose gel, and the band pattern will tell you if the individual is homozygous T, homozygous C, or heterzygous T/C. This methodology has several applications, such as amplifying certain haplotypes (when certain alleles at 2 or more SNPs occur together on the same chromosome [Linkage Disequilibrium]) or detection of recombinant chromosomes and the study of meiotic recombination.

Comparison of gene expression

Researchers have used traditional PCR as a way to estimate changes in the amount of a gene's expression. Ribonucleic acid (RNA) is the molecule into which DNA is transcribed prior to making a protein, and those strands of RNA that hold the instructions for protein sequence are known as messenger RNA (mRNA). Once RNA is isolated it can be reverse transcribed back into DNA (complementary DNA to be precise, known as cDNA), at which point traditional PCR can be applied to amplify the gene, this methodology is called RT-PCR. In most cases if there is more starting material (mRNA) of a gene then during PCR more copies of the gene will be generated. When the product of the PCR reaction are run on an agarose gel (see Figure 3 above) a band, corresponding to a gene, will appear larger on the gel (note that the band remains in the same location relative to the ladder, it will just appear fatter or brighter). By running samples of amplified cDNA from differently treated organisms one can get a general idea of which sample expressed more of the gene of interest. A quantative RT-PCR method has been developed, it is called Real-Time PCR.


شاهد الفيديو: Analyze primers on a plasmid using ApE (يوليو 2022).


تعليقات:

  1. Smedt

    أعتقد أنهم مخطئون. أنا قادر على إثبات ذلك. اكتب لي في PM.

  2. Tulkis

    Excuse, I can help nothing. But it is assured, that you will find the correct decision. لا تيأس.

  3. Cletus

    مثل قراءة باهتمام ، ولكن لم يفهم



اكتب رسالة