معلومة

دور الأيزوبروبانول في عزل البلازميد

دور الأيزوبروبانول في عزل البلازميد


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

في عزل البلازميد ، يتم استخدام الأيزوبروبانول لإعادة تجديد جزيئات البلازميد فقط بعد أن نقوم بترسيب جميع الجزيئات الكبيرة (DNA ، RNA ، البلازميدات) باستخدام محلول أسيتات الصوديوم. كيف تفعل ذلك؟ كيف لا يعيد ترتيب كل جزيء كبير آخر؟


في إجراء تحضيري معياري للحمض النووي ، يُستخدم الأيزوبروبانول لترسيب الحمض النووي. الأحماض النووية غير قابلة للذوبان في الكحول ، وتتجمع أو تلتصق ببعضها البعض. يمكن تعزيز هذا الالتصاق معًا عن طريق زيادة القوة الأيونية مثل إضافة أسيتات الصوديوم.

الكحوليات في الحقيقة لا تفسد الحمض النووي.


لا يمكن دمج الطرق التقليدية لاستخراج الحمض النووي ، مثل ترسيب الإيثانول أو المستحضرات التي تستخدم مجموعات تنقية تجارية ، في الرقائق الدقيقة لأنها تتطلب خطوات معالجة عملية متعددة. بالإضافة إلى ذلك ، فهي تتطلب أيضًا معدات كبيرة وكميات كبيرة من الكواشف والعينات. تتجنب راتنجات السيليكا هذه المشكلات من خلال التكامل على الرقائق الدقيقة ، حيث يوفر استخراج المرحلة الصلبة تحليلًا دقيقًا للحمض النووي على نطاق صغير. [3]

من أجل إجراء فصل الحمض النووي عن طريق امتصاص السيليكا ، يتم وضع عينة (قد تكون أي شيء من الخلايا النقية إلى عينة الأنسجة) على شريحة متخصصة ويتم تحليلها. يتم بعد ذلك تشغيل المزيج الناتج من البروتينات والحمض النووي والفوسفوليبيد وما إلى ذلك عبر القناة حيث يتم امتصاص الحمض النووي بواسطة سطح السيليكا في وجود محاليل ذات قوة أيونية عالية. تحدث أعلى كفاءة لامتصاص الحمض النووي في وجود محلول عازل مع درجة حموضة عند أو أقل من pKa لمجموعات silanol السطحية.

الآلية الكامنة وراء امتزاز الحمض النووي على السيليكا ليست مفهومة تمامًا ، أحد التفسيرات المحتملة تتضمن تقليل الشحنة السالبة لسطح السيليكا بسبب القوة الأيونية العالية للمخزن المؤقت. يؤدي هذا الانخفاض في شحنة السطح إلى انخفاض في التنافر الكهروستاتيكي بين الحمض النووي المشحون سالبًا والسيليكا سالبة الشحنة. وفي الوقت نفسه ، يقلل المخزن المؤقت أيضًا من نشاط الماء عن طريق تنسيق الأيونات الرطبة. وهذا يؤدي إلى جفاف سطح السيليكا والحمض النووي. تؤدي هذه الظروف إلى حالة مواتية بقوة لامتصاص الحمض النووي على سطح السيليكا. [ بحاجة لمصدر ]

ويستند تفسير آخر لكيفية ارتباط الحمض النووي بالسيليكا على عمل غوانيدينيوم حمض الهيدروكلوريك (GuHCl) ، والذي يعمل بمثابة chaotrope. تفسد Chaotrope الجزيئات الحيوية عن طريق تعطيل قشرة الماء من حولها. يسمح هذا للأيونات الموجبة الشحنة بتكوين جسر ملح بين السيليكا سالبة الشحنة والعمود الفقري للحمض النووي سالب الشحنة في تركيز الملح العالي. يمكن بعد ذلك غسل الحمض النووي بكمية عالية من الملح والإيثانول ، ثم التصفية النهائية بملح منخفض.

بعد امتصاص الحمض النووي على سطح السيليكا ، تمر جميع الجزيئات الأخرى عبر العمود. على الأرجح ، يتم إرسال هذه الجزيئات إلى قسم النفايات على الرقاقة ، والتي يمكن بعد ذلك إغلاقها باستخدام قناة مسورة أو غرفة يتم التحكم فيها بالضغط أو الجهد. يتم بعد ذلك غسل الحمض النووي لإزالة أي جزيئات نفايات زائدة من العينة ثم إزالتها من القناة باستخدام محلول شطف مؤقت لمزيد من المعالجة النهائية. [ بحاجة لمصدر ]

تم اقتراح الحلول التالية والتحقق من صحتها للاستخدام في هذه العملية ربط الحمض النووي: غسل القناة العازلة القائم على GuHCl: 80٪ شطف حمض الأيزوبروبانول: TE عند الرقم الهيدروجيني 8.4. [ بحاجة لمصدر ]

تم إنشاء طرق باستخدام حبيبات السيليكا وراتنجات السيليكا التي يمكنها عزل جزيئات الحمض النووي لتضخيم PCR اللاحق. ومع ذلك ، فإن هذه الأساليب لها مشاكل مرتبطة. أولاً ، تختلف الخرزات والراتنجات بشكل كبير اعتمادًا على مدى جودة تعبئتها وبالتالي يصعب إعادة إنتاجها. يمكن أن يؤدي كل تحميل لقناة صغيرة إلى كمية مختلفة من التعبئة وبالتالي تغيير كمية الحمض النووي التي تمتص في القناة. علاوة على ذلك ، تؤدي هذه الطرق إلى عملية تصنيع من خطوتين.

تعتبر هياكل السيليكا طريقة أكثر فاعلية لتعبئة المواد لأنها محفورة في القناة أثناء تصنيعها ، وبالتالي فهي نتيجة لعمليات التصنيع خطوة واحدة عبر الطباعة الحجرية اللينة. وبالتالي ، فإن هياكل السيليكا أسهل في الاستخدام في التصميمات المتوازية للغاية مقارنة بالخرز أو الراتنجات.


خطوة واحدة طريقة "miniprep" لعزل DNA البلازميد

تتضمن جميع طرق "miniprep" التي تم الإبلاغ عنها حتى الآن لعزل DNA البلازميد عدة ماصات واستخلاص وطرد مركزي وتغييرات في أنابيب minifuge. وبالتالي ، فإن فحص عدد كبير من العينات يكون مرهقًا ويستغرق وقتًا طويلاً وغير اقتصادي.

التقرير الفني أدناه بواسطة Chowdhury، K. (1991) هو إجراء سريع جدًا وبسيط وخطوة واحدة "miniprep". إن جودة وكمية الحمض النووي التي تم الحصول عليها باستخدام هذا الإجراء مماثلة لتلك التي تم الحصول عليها من خلال إجراءات سيرغيني الأخرى الشائعة الاستخدام وآخرون. (1) أو بيربويم ودولي (2). وفقًا لهذا الإجراء ، يتم استخلاص الثقافة البكتيرية مباشرة بمزيج من كحول الفينول - كلوروفورم - أيزو أميل ويتم ترسيب الحمض النووي المحرر باستخدام الأيزوبروبانول. تُستخدم هذه الطريقة الآن بشكل روتيني في مختبرنا لعزل البلازميدات التي يصل حجمها إلى 12 كيلو بايت. ويرد وصف تفصيلي للطريقة أدناه:

1. خذ 0.5 مل من مزرعة الإشريكية القولونية طوال الليل في أنبوب ميكروفيج. نحن نزرع خلايانا بشكل روتيني في وسط بكتيريولوجي "قياسي 1" مقدم من شركة ميرك الألمانية.

2. أضف 0.5 مل من الفينول: كلوروفورم: كحول أيزو أميلي (25: 24: 1). تم تشبع الفينول بـ TE (10mM Tris، 7.5، 1mM EDTA) قبل الخلط مع الكلوروفورم و isoamylalcohol.

3. امزج بالدوامة بأقصى سرعة لمدة دقيقة واحدة. بدلاً من ذلك ، دوامة لمدة 10 ثوانٍ ثم انقلها إلى خلاط إيبندورف أو دوار علوي لمدة 5 دقائق.

4. تدور في 12000 جم لمدة 5 دقائق. أثناء الدوران ، قم بإعداد أنابيب ميكروفوج مع 0.5 مل من الأيزوبروبانول. بعد الدوران ، قم بإزالة حوالي 0.45 مل من الطور المائي العلوي بحذر مع ترك الطور البيني دون عائق وأضفه إلى الأيزوبروبانول. تخلط جيدا وتدور على الفور عند 12000 جم لمدة 5 دقائق. إضافة الملح والتبريد غير ضروري.

5. اسكب المادة الطافية ، وأضف بحرص 0.5 مل من الإيثانول بنسبة 70٪ إلى جانب الأنبوب ، ثم اسكبه. كرر الغسيل مرة أخرى. تجفيف الحبيبات بالمكنسة الكهربائية وتعليقها في 100ul / ml RNAse). يمكن الآن شق حوالي 5-10ul من هذا الحمض النووي باستخدام إنزيم (إنزيمات) التقييد المناسب للتحليل.


بكتريا قولونية بروتوكول MiniPrep DNA البلازميد

عزل DNA البلازميد من بكتريا قولونية استخدام التحلل القلوي طريقة راسخة. بكتريا قولونية مع البلازميد في وسط يحتوي على مضادات حيوية بكثافة عالية للخلايا ، ثم يتم حصادها ، ثم تحللها بمحلول SDS / NaOH. يؤدي التحمض السريع باستخدام أسيتات البوتاسيوم المركزة إلى ترسيب البروتين والحمض النووي الصبغي. يبقى DNA البلازميد ، وهو ملفوف بشكل فائق ، في محلول ويمكن التقاطه على عمود تدور السيليكا. يتم غسل DNA البلازميد بمحلول إيثانول ثم يتم التصفية منه في الماء أو محلول TE.

  • أنابيب ميكروفوج
  • عازلة إعادة التعليق (50 ملي تريس حمض الهيدروكلوريك ، درجة الحموضة 8 ، 10 مم EDTA ، 100 & ميكروغ / مل RNase A)
  • عازلة تحلل (0.2 N هيدروكسيد الصوديوم ، 1٪ SDS)
  • المخزن المؤقت للتحييد (3/5 M أسيتات البوتاسيوم ، الرقم الهيدروجيني 6)
  • أعمدة الدوران (رقم المنتج SSC 100-01)
  • الأيزوبروبانول
  • غسل العازلة (70٪ إيثانول)
  • شطف عازلة (ماء أو عازل TE- 10 مم تريس ، درجة الحموضة 8 ، 1 مم EDTA)

حضاره بكتريا قولونية بالبلازميد في وسط LB مع ضغط انتقائي للمضادات الحيوية ، طوال الليل على شاكر عند 37 درجة مئوية.

بيليه 1.5 مل من الثقافة البكتيرية في أنبوب microfuge عن طريق الطرد المركزي لمدة دقيقتين عند 10000 دورة في الدقيقة.

صب المادة طافية وإضافة 200 ميكرول من المخزن المؤقت لإعادة التعليق. من أجل إعادة تعليق الحبيبات ، قد تضطر إلى الدوران.

أضف 250 وميكرول من محلول التحلل ، اقلب الأنبوب 10 مرات لخلطه جيدًا. يجب أن يصبح المحلول واضحًا ولزجًا.

أضف 350 & ميكرول من المخزن المؤقت للتحييد ، اقلب الأنبوب 10 مرات أو حتى تتشكل راسب. الراسب عبارة عن خليط من البروتين والحمض النووي الصبغي.

الطرد المركزي الأنبوب لمدة 10 دقائق عند 10000 دورة في الدقيقة. نقل المادة طافية إلى أنبوب microfuge وإضافة 0.7 الأيزوبروبانول. احتضان عند -20 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.

انقل المحلول إلى عمود الدوران.

الطرد المركزي عمود الدوران لمدة 1 دقيقة عند 7000 دورة في الدقيقة. تجاهل التدفق من خلال.

أضف 400 ميكرول من المخزن المؤقت للغسيل وجهاز الطرد المركزي لمدة دقيقة واحدة عند 7000 دورة في الدقيقة. تجاهل التدفق من خلال. كرر هذه الخطوة.

الطرد المركزي لمدة دقيقتين إضافيتين عند 10000 دورة في الدقيقة لإزالة المخزن المؤقت للغسيل المتبقي.

نقل العمود إلى أنبوب microfuge نظيف. أضف 50 ميكرول من محلول الشطف وجهاز الطرد المركزي لمدة دقيقة واحدة عند 10000 دورة في الدقيقة.

الجدول 1: تمت قراءة البلازميد المخفف على مقياس الطيف الضوئي DeNovix لتحديد التركيز. تم تفريغ الآلة بمياه DI.

اسم عينة التركيز (نانوغرام / وميكرول) 260/280 260/230
بكتريا قولونية DH5α مع pSVβ 1143.41 2.06 2.38

شكل 1: خضع البلازميد المعزول تحت هضم إنزيمي مع HindIII (مصدره NEB) وتم تشغيله على Agarose Gel مع Ethidium Bromide ، على طول جانبين من سلالم Lambda المهضومة (انقر لتكبير الصورة).


  • لتنقية DNA البلازميد من بكتريا قولونية الخلايا
  • لشظايا الحمض النووي النموذجية (وطولها 200 نقطة أساس)

المنتجات من القيد تحتاج إلى إزالة عدد من الكواشف من القيد السابق. وتشمل هذه الأملاح (من المحاليل المنظمة) وإنزيمات التقييد. يمكن إزالة الحمض النووي وغسله من المحلول باستخدام مجموعات تنقية العمود. فيما يلي وصف تقريبي لكيفية عمل المجموعة.

الخطوة 1: تعزيز الشحنة السالبة للحمض النووي. الحمض النووي مشحون سالبًا بسبب العمود الفقري للفوسفات ، لذا فإن هذه الخطوة تعزز الشحنة السالبة. في مجموعة Qiagen ، يحتوي محلول PB على كلوريد الجوانين ، ومنظف البروتين ومُحول الطبيعة. المحلول أيضًا حمضي قليلاً بسبب انخفاض درجة الحموضة

الخطوة 2: الصق الحمض النووي السالب بالراتنج موجب الشحنة. قم بتحميل منتج DNA سالب الشحنة في الأنبوب وطرده (عادة حوالي 14000 دورة في الدقيقة لمدة دقيقة واحدة).

الخطوة 3: اغسل الحمض النووي لإزالة قطع صغيرة من الحمض النووي. يتم تحقيق ذلك باستخدام المخزن المؤقت للإيثانول و Tris ويوصف بأنه المخزن المؤقت "PE" في مجموعة Qiagen. يذوب هذا المحلول قطعًا أصغر من الحمض النووي بحيث يمكن استخلاصها من العمود. بشكل عام ، تضيف كمية كبيرة من هذه الأشياء وتدور العمود (

750 مل من المخزن المؤقت PE ، تدور لمدة 1 دقيقة).

الخطوة 4: إزالة EtOH الزائدة. بعد التخلص من EtOH من الخطوة السابقة ، يكون الدوران الآخر جيدًا لإزالة كل EtOH من العمود والحمض النووي حتى لا يدخل المنتج النهائي المزال. تدور لمدة 12 دقيقة عند 14000 دورة في الدقيقة).

الخطوة 5: الشطف. شطف العازلة هو Tris buffer مع بعض EDTA عند درجة حموضة 8-8.5. يرتبط EDTA بالكاتيونات ثنائية التكافؤ ، وخاصة المغنيسيوم (Mg2 +). يحتوي Tris على بروتونات قابلة للتغير مع pKa يبلغ 8.30 (عند 20 درجة مئوية ، ينخفض ​​هذا حوالي 0.03 وحدة لكل درجة مئوية ارتفاع في درجة الحرارة). غالبًا ما يستخدم تريس عند العمل مع الأحماض النووية. تريس هو عازلة فعالة للحلول الأساسية قليلاً ، والتي تحافظ على الحمض النووي منزوع الدنا وقابل للذوبان في الماء. هذه الأيونات هي عوامل مساعدة ضرورية للعديد من الإنزيمات.المغنيسيوم عامل مساعد للعديد من الإنزيمات المعدلة للحمض النووي. تريس سام لخلايا الثدييات ، ويتفاعل بقوة مع أقطاب الأس الهيدروجيني. وهو أمين أساسي ، وبالتالي يمكن أن يتفاعل مع الألدهيدات.


أ. تمليح

ترسيب البروتينات بتركيزات عالية من الملح.

DANAGENE SALIVA KIT

تسمح لك هذه المجموعة بعزل الحمض النووي من عينة لعاب الطلاب للحصول على حمض نووي عالي الجودة لاستخدامه في تفاعل البوليميراز المتسلسل.

& gt Kit تشمل:
محلول تحلل ، محلول ترسيب البروتين ومحلول ترطيب الحمض النووي.
& gt تحتاج:
ماصات ميكروية وأنابيب دقيقة وأجهزة طرد مركزي وأيزوبروبانول و 70٪ إيثانول.

0603.4 50 طالبًا
0603.41 160 طالب وطالبة

DANAGENE BLOOD DNA KIT

تسمح لك هذه المجموعة بعزل الحمض النووي من عينة الدم للحصول على DNA عالي الجودة لاستخدامه في تفاعل البوليميراز المتسلسل.

& gt Kit تشمل:
محلول RBC ، محلول تحلل ، محلول ترسيب البروتينات ومحلول ترطيب الحمض النووي.
& gt تحتاج:
الماصات الدقيقة ، الأنابيب الدقيقة ، أجهزة الطرد المركزي الدقيقة ، الأيزوبروبانول و 70٪ من الإيثانول.

0601100 مل / دم
0602 200 مل / دم

DANAGENE PLANT DNA KIT

تتيح لك هذه المجموعة عزل الحمض النووي من عينات النباتات المختلفة للحصول على DNA عالي الجودة لاستخدامه في تفاعل البوليميراز المتسلسل.

& gt Kit تشمل:
محلول استخلاص ، محلول تحلل ، RNAse ، محلول PVP ، محلول ترسيب البروتين ومحلول ترطيب DNA.
& gt تحتاج:
الماصات الدقيقة ، الأنابيب الدقيقة ، أجهزة الطرد المركزي الدقيقة ، الأيزوبروبانول و 70٪ من الإيثانول.

0604.1 50 قلع
0604.2 200 قلع


تساعد البلازميدات البكتيريا على النجاة من الإجهاد

تحتوي البلازميدات على عدد قليل من الجينات ، لكنها تحدث فرقًا كبيرًا في البكتيريا المضيفة. عادةً ما لا تكون الجينات ضرورية لبقاء البكتيريا يومًا بعد يوم - وبدلاً من ذلك ، فهي تساعد البكتيريا على التغلب على المواقف العصيبة العرضية. على سبيل المثال ، تحتوي العديد من البلازميدات على جينات ، عند التعبير عنها ، تجعل البكتيريا المضيفة مقاومة للمضادات الحيوية (لذلك لن تموت عند معالجتها بهذا المضاد الحيوي). تحتوي البلازميدات الأخرى على جينات تساعد المضيف على هضم مواد غير عادية أو قتل أنواع أخرى من البكتيريا.


نصائح للفحص باللونين الأزرق والأبيض

  • استخدم عنصر تحكم جيد: تحويل بلازميد العمود الفقري بدون إدخال. يجب أن تكون جميع المستعمرات الموجودة على هذه اللوحة باللون الأزرق ، مما يشير إلى أن IPTG و x-gal يعملان كما ينبغي.
  • لا تتسرع في العملية: من المهم إعطاء أطباقك وقتًا كافيًا للتعبير عن أي β-galactosidase سليم ومعالجة x-gal إلى صبغة زرقاء (16-20 ساعة). الطبق الذي يحتوي على مستعمرات بيضاء فقط أمر مشكوك فيه للغاية!
  • برد الأطباق الخاصة بك: يؤدي وضع الأطباق في درجة حرارة 4 درجات مئوية لبضع ساعات بعد فترة الحضانة الأولية الليلية إلى زيادة ترسيب الصبغة ، ويعزز اللون الأزرق للمستعمرات السلبية ، ويسمح بتمييز أفضل بين المستعمرات الزرقاء والبيضاء.
  • احرص على صنع لوحاتك: X-gal حساس للضوء ودرجة الحرارة ويجب إضافته إلى الوسائط بعد التعقيم. إذا انتشرت فوق أطباق مسبقة الصنع ، فتأكد من توزيعها بالتساوي واترك وقتًا كافيًا للتجفيف قبل الاستخدام.
  • احذر من الإيجابيات الكاذبة: يشير الفرز الأزرق والأبيض فقط إلى وجود ملحق ، وليس بالضرورة الملحق الخاص بك. أي أداة استنساخ تعطل الحمض النووي للببتيد α ستؤدي أيضًا إلى مستعمرة بيضاء.
  • وكذلك السلبيات الكاذبة: هذه نادرة ، ولكن إذا تم إدخال جزء صغير في الإطار ، يمكن أن تؤدي القراءة إلى إنزيم β-galactosidase وظيفي ومستعمرة زرقاء. يعد فحص الأزرق والأبيض طريقة جيدة لتضييق نطاق المرشحين لإجراء تحليل أكثر تحديدًا ، مثل PCR أو ملخص التقييد.
  • تأكد من استخدام سلالة الإشريكية القولونية المناسبة (أي يحتوي على طفرة lacZΔM15): XL1-Blue و DH5α و DH10B و JM109 و STBL4 و JM110 و Top10 هي أمثلة قليلة.
  • تأكد من استخدام البلازميد المناسب (أي يحتوي على MCS لاستنساخ α-مكمل): pGEM-T و pUC18 و pUC19 و pBluescript هي بعض النواقل الشائعة.

فحص الأزرق والأبيض هو مجرد عملية فحص. إنه لا يختار فقط تلك الخلايا التي تناولت البلازميد وبالتالي يجب استخدامها جنبًا إلى جنب مع طرق الاختيار. يضمن الجمع بين الاختيار والفحص أن تكون المستعمرات البيضاء التي تراها بيضاء بسبب الاستنساخ الناجح وليس لأن الخلية فشلت في تناول البلازميد التكميلي α. بهذه الطريقة يمكنك التعرف بسرعة وسهولة على المستعمرات التي لا تحتوي فقط على البلازميد (مقاومة المضادات الحيوية) ، ولكن أيضًا تؤكد أن تلك البلازميدات تحتوي على مدخلاتك (الفحص بالأبيض والأزرق).


DNA miniprep بواسطة Alkaline Lysis (نشاط)

بمجرد إدخال الحمض النووي وحمله في البكتيريا ، نود عزل الحمض النووي مرة أخرى لمزيد من التلاعب. من أجل القيام بذلك ، يتم زراعة البكتيريا التي تحتوي على البلازميد المعني في مزرعة سائلة من مرق غني بالمغذيات مصنوع من مستخلص الخميرة يسمى Luria-Bertani Broth ( رطل ). وتزرع هذه البكتيريا المستنبتة حتى تصبح عالية التركيز خلال الليل. يتم حصادها عن طريق الطرد المركزي ويتم إزالة المرق. يتم تعليق الحبيبات الناتجة من البكتيريا في مخزن مؤقت فسيولوجي يحتوي على مادة مخلبة EDTA. أ خالب هي مادة كيميائية تزيل الكاتيونات ثنائية التكافؤ مثل Ca 2+ أو Mg 2+ من المحلول. هذا مهم لأن الكاتيونات ثنائية التكافؤ ضرورية لكي تكون إنزيمات هضم الحمض النووي نشطة. عن طريق تخليب الأيونات ، فإن الحمض النووي الذي نرغب في تنقيته في النهاية سيكون في مأمن من التدهور.

بعد إعادة تعليق البكتيريا ، يتم خلط محلول قلوي من 0.1N هيدروكسيد الصوديوم في المزيج البكتيري. يحتوي هذا المحلول أيضًا على منظف أيوني يسمى كبريتات دوديسيل الصوديوم ( SDS ) التي تساعد في تغيير طبيعة البروتينات وتعطيل تفاعلاتها مع الحمض النووي. يصبح الخليط لزجًا عندما تنفجر البكتيريا وتتسرب محتوياتها إلى المحلول. يتم بعد ذلك تحييد هذا المحلول الأساسي باستخدام محلول أسيتات البوتاسيوم عند درجة الحموضة 5.5. عندما تختلط المحاليل معًا ، يقترب الأس الهيدروجيني من 7 ويتفاعل البوتاسيوم مع SDS لإحداث ترسيب للحمض النووي والبروتينات الصبغي الجيني. من أجل فصل الراسب عن المحلول ، يتم طرد الخليط بسرعة عالية لتكوير الحمض النووي الجيني والبروتين. ال طاف ، أو الحل ، إلى عمود يحتوي على أ غشاء السيليكا . في ظل ظروف الملح العالية ، يلتصق الحمض النووي بالزجاج أو السيليكا. عن طريق تمرير المحلول عبر هذا العمود ، يتم احتجاز DNA البلازميد الموجود في المادة الطافية على غشاء السيليكا وإزالته من المحلول. يتم استخدام غسالات إضافية لإزالة الملوثات الشاردة وإزالة الملح الزائد. يتم أخيرًا إزالة DNA البلازميد من العمود من خلال شطف بواسطة عازلة منخفضة الملح. هذا المخزن المؤقت منخفض الملح هو Tris pH 8 مع EDTA ( TE ). يمكن تخزين DNA البلازميد بثبات في المخزن المؤقت TE في الثلاجة لفترات طويلة.


تحويل DNA البلازميد إلى الإشريكية القولونية باستخدام طريقة الصدمة الحرارية

يعتبر تحويل DNA البلازميد إلى الإشريكية القولونية باستخدام طريقة الصدمة الحرارية تقنية أساسية في البيولوجيا الجزيئية. يتكون من إدخال بلازميد غريب أو منتج ربط في البكتيريا. يصف بروتوكول الفيديو هذا الطريقة التقليدية للتحول باستخدام البكتيريا المختصة كيميائياً المتوفرة تجارياً من Genlantis. بعد فترة حضانة قصيرة في الجليد ، يوضع مزيج من البكتيريا المختصة كيميائياً والحمض النووي عند 42 درجة مئوية لمدة 45 ثانية (صدمة حرارية) ثم يوضع مرة أخرى في الجليد. تضاف وسائط SOC وتحضن الخلايا المحولة عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة مع التحريض. للتأكد من عزل المستعمرات بغض النظر عن كفاءة التحول ، يتم طلاء كميتين من البكتيريا المحولة. يمكن استخدام هذا البروتوكول التقليدي بنجاح لتحويل معظم البكتيريا المختصة المتوفرة تجاريًا. يمكن أيضًا استخدام الخلايا التوربينية من Genlantis في بروتوكول تحويل جديد مدته 3 دقائق ، كما هو موضح في دليل التعليمات.


شاهد الفيديو: HIRARC of Isopropanol (يوليو 2022).


تعليقات:

  1. Qudamah

    دعونا نتحدث ، لدي ما أقوله.

  2. Dearbourne

    عبارة قيّمة جدا

  3. Serapis

    قل لي أين يمكنك الحصول على مثل هذه المقالات؟

  4. Willie

    برافو ، سيكون لهذا الفكرة المختلفة بالمناسبة



اكتب رسالة