معلومة

استخدام نوكليازات التقييد لتحليل التكرارات الترادفية للأرقام المتغيرة (VNTRs)


ينص الكتاب المدرسي الذي أستخدمه على أن "نهايات VNTR قد حفظت التسلسلات. يمكن قطعها بسهولة عن طريق نوكليازات تقييدية ".

لكن نوكليازات التقييد تشق متواليات متناظرة. هل هذا يعني أن الحمض النووي المتكرر والمتواليات المحفوظة معًا تشكل تسلسلًا متناوبًا؟


يمكن شرح الموقف العام المتعلق باستخدام نوكليازات التقييد لتحليل التكرارات الترادفية للأرقام المتغيرة بالرجوع إلى الرسم التوضيحي أدناه (وكذلك بدونه).

ستكون المنطقة الأصلية من الحمض النووي التي يحدث فيها الإدخال معقدة بشكل عام (بدلاً من تكرارها) ويتم الحفاظ عليها إلى حد معقول بين H. العاقل. يتم تمثيل التسلسل المعقد المحفوظ بتدرج لوني في الجزء العلوي من الرسم التخطيطي بحيث يمكن تحديد النقطة التي يتم عندها تحديد النسخة الأصلية للتكرار المُدرج في أفراد مختلفين (أو الأليلات) ، A ، B و C ، حيث ، من أجل الجدل ، تم إنشاء نسختين وثلاث وأربع نسخ.

وحدة التكرار الفردية قصيرة نسبيًا (عادةً 10-100 نقطة أساس) ، لذلك من السهل نسبيًا العثور على مواقع محفوظة لنووكلياز داخلي واحد على الأقل متاح تجاريًا للتقييد على جانبي الإدخال الأصلي ، ولكن ليس ضمن التكرار.

إن رياضيات هذا المنطق بسيطة للغاية ، وأنا أقدم التدريبات على موقع الجامعة الخاص بي. ومع ذلك ، على سبيل المثال ، ضع في اعتبارك تسلسل زوج من 4 قواعد هو هدف إنزيم التقييد. لا يلزم أن يكون متناوبًا ، ولكن نظرًا لأن معظم نوكليازات التقييد من النوع الأول ، دعنا نختار GGCC. فرصة العثور على هذا في أي رباعي نيوكليوتيد هي 1 في 256 (4x4x4x4) ، أو بعبارة أخرى ، يجب أن يحدث في أي امتداد 256 زوج قاعدي للحمض النووي. (بالطبع هذا مجرد متوسط ​​لما قد يكون توزيعًا طبيعيًا ، وسيؤثر التكوين الأساسي العام على التردد الفعلي.)

ستكون النتيجة النهائية أنه سيكون من الممكن إنشاء أجزاء ذات حجم إجمالي بحيث لا تكون المناطق المحيطة كبيرة جدًا بحيث تجعل من الصعب تمييز الاختلافات التي تعكس أعدادًا مختلفة من التكرارات.

و اليوم؟

يمكن استخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) بدلاً من تقييد هضم نوكلياز داخلي ، نظرًا لأنه تم تحديد تسلسل الحمض النووي للمنطقة ، يمكن للمرء اختيار المواضع المناسبة في المناطق المحيطة لتوليد شظايا الحمض النووي للتحليل. انظر ، على سبيل المثال ريتشي وآخرون. (1999).


البروتوكولات

جريجوري أ. دينوم دكتوراه ،. ماريون إي ريد ، دكتوراه في البروتوكولات الجزيئية في طب نقل الدم ، 2000

مبدأ

عدد متغير من التكرار الترادفي (VNTR) وتسلسلات التكرار الترادفي القصيرة (STR) هي امتدادات متكررة موروثة من الحمض النووي من مئات (VNTRs) إلى عدد قليل من النيوكليوتيدات (STRs) الموجودة عمومًا في المناطق غير المشفرة من الجينوم البشري. تُظهر امتدادات الحمض النووي هذه عدم تجانس الحجم بين البشر ويتم توريثها بطريقة مشتركة مهيمنة. في الاختبار ، يتم تمديد بادئات قليل النوكليوتيد ، المرافقة لـ VNTR / STR ، باستخدام PCR. يتم استخدام Agarose أو polyacrylamide الكهربائي للهلام لتقدير أحجام جزء PCR ، على التوالي VNTR و STR.


عدد متغير يتكرر جنبا إلى جنب

الفرق في تسلسل النيوكليوتيدات بين البشر يتراوح بين 0.1-0.4٪. هذا يعني أن الناس أكثر تشابهًا بنسبة 99٪. لكن عندما تنظر حول الغرفة إلى زملائك في الفصل ، يمكنك أن ترى أن هذا الاختلاف الصغير يرقى إلى حد كبير من الاختلاف داخل جنسنا البشري. لم يكن الجزء الأكبر من هذه الاختلافات & # 8217t حتى داخل تسلسل ترميز الجينات ، ولكنها تقع في الخارج في المناطق التنظيمية التي تغير التعبير عن تلك الجينات. تخيل لو كانت هناك طفرات في تسلسل التشفير ، فقد يكون هذا ضارًا جدًا برفاهية الكائن الحي. نقول إن تسلسل ترميز الجينات التي تؤدي في النهاية إلى البروتينات لها أ الضغط الانتقائي لتبقى على حالها. المناطق خارج تسلسلات التشفير لها ضغط اختيار منخفض وأحيانًا غير موجود. يُسمح لهذه المناطق بالتحول في التسلسل وحتى التوسع أو الانكماش. يتم استدعاء مجالات التغييرات أو الاختلافات متعدد الأشكال (اشكال عديدة). إذا كنت ستقرأ مجموعة متكررة من المتواليات وتحسب التكرار ، فأنت & # 8217d ترتكب أخطاء وتفقد العد. وبالمثل ، الحمض النووي
سيحدث البوليميراز أخطاء أو تلعثم في مناطق التكرار وينتج مناطق متعددة الأشكال.

يحدث نوع من تعدد الأشكال بسبب توسع وتقلص هذه التكرارات في المناطق غير المشفرة. تسمى هذه المناطق عدد متغير متكرر الترادف ( VNTRs )
أو أحيانًا يتكرر ترادفيًا قصيرًا ( تقارير المعاملات المشبوهة ). يشار إلى أي منطقة أو موقع على الكروموسوم باسم المكان (loci للجمع). يستخدم العلماء مواقع متعددة الأشكال معروفة
تحتوي على VNTRs / STRs من أجل التمييز بين الأشخاص بناءً على حمضهم النووي. غالبًا ما يستخدم هذا في علم الطب الشرعي أو في حالات الأمومة / الأبوة. يشار إلى أي اختلاف في المكان باسم أليل . في علم الوراثة القياسي ، غالبًا ما نفكر في الأليل باعتباره نوعًا مختلفًا من الجين الذي من شأنه أن يؤدي إلى اختلاف في المظهر المادي لهذا الجين. في حالة المعاملات المشبوهة ، فإن هذه الأليلات هي ببساطة اختلاف في عدد https://openlab.citytech.cuny.edu/bio1-oer/repeats. هذا يعني أن طول الحمض النووي داخل هذا الموضع إما أطول أو أقصر ويؤدي إلى ظهور العديد من الأليلات المختلفة.

طور مكتب التحقيقات الفيدرالي ووكالات إنفاذ القانون المحلية قاعدة بيانات تسمى نظام مؤشر الحمض النووي المشترك ( CoDIS ) التي تجمع بيانات عن عدد من تقارير المعاملات المشبوهة. من خلال تحديد عدد التكرارات لموضع معين ، يمكن لمسؤولي إنفاذ القانون التمييز بين الأفراد بناءً على طول تكرار هذه الأليلات. يستخدم CoDIS ملف
مجموعة من 13 موقعًا تم اختبارها معًا. كما تتخيل ، لا بد أن يكون لدى الأشخاص نفس الأليلات لمواقع معينة ، خاصةً إذا كانت مرتبطة ببعضها البعض. استخدام 13 موقعًا مختلفًا يجعل من غير المحتمل إحصائيًا أن يتم الخلط بين شخصين مختلفين لبعضهما البعض. فكر في هذا من حيث السمات الجسدية. كلما زادت عدد السمات الجسدية المستخدمة لوصف شخص ما ، فمن غير المرجح أن تخلط بين هذا الشخص وشخص آخر بناءً على تلك المجموعات من السمات. يؤدي استخدام موقع CoDIS إلى زيادة الصرامة نظرًا لوجود العديد من الأليلات لكل موضع. يميز المكان الثالث عشر في CoDIS (المسمى AMEL) بين الذكر والأنثى.

تقارير CoDIS STRs: يستخدم مكتب التحقيقات الفيدرالي 13 موقعًا مختلفًا للتمييز بين الأشخاص. يميز AMEL حسب الجنس ويقع في X & amp Y.

يستخدم هذا المعمل موضع CoDIS يسمى TH01. TH01 هو موضع على الكروموسوم 11 يحتوي على تسلسل متكرر من TCAT. تم الإبلاغ عن وجود ما بين 3-14 تكرارًا في هذا الموضع. باستثناء X و Y في الذكر ، فإن كل الكروموسومات لها شريك متماثل. لذلك ، سيكون لكل فرد أليلين لكل موضع CoDIS.

TH01 STR: خارج نطاق STR ، توجد مناطق مجاورة ذات تسلسل معروف. تتعرف البادئات التي تضخم TH01 في PCR على هذه التسلسلات المرافقة لتضخيم تكرارات TCAT.

في مسرح الجريمة ، لا يترك المجرمون في كثير من الأحيان كميات هائلة من الأنسجة خلفهم. يمكن أن تكون الأدلة الضئيلة في شكل بضع خلايا موجودة داخل سوائل الجسم أو الشعر الشارد كافية لاستخدامها كدليل على الحمض النووي. يتم استخراج الحمض النووي من هذه الخلايا القليلة وتضخيمه بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام البادئات المحددة التي تحيط بـ STRs المستخدمة في CoDIS.

دليل الحمض النووي من مسرح الجريمة: يمكن استخراج الحمض النووي من الخلايا الموجودة من مصادر مختلفة في مسرح الجريمة. يمكن لـ PCR تضخيم هذه الكمية الصغيرة من الحمض النووي.

سيتم فصل الحمض النووي المتضخم عن طريق الرحلان الكهربائي للهلام وتحليله. سيتم تحليل المعايير المرجعية للحجم والعينات من مسرح الجريمة والمشتبه بهم المفترضين معًا. في اختبار الأبوة ، سيتم تحليل عينات من الأم والطفل والأب المشتبه به بنفس الطريقة. ستوفر مسحة خد بسيطة ما يكفي من الخلايا
هذا الاختبار.

موضع TH01 المستخدم في اختبار الأبوة / الأمومة: يتم تشغيل تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) الفردية لكل عينة (أمي ، أبي ، طفل). يقوم زوج التمهيدي TH01 بتضخيم الموضع على وجه التحديد. يتم تشغيل كل عينة مكبرة على نفس الهلام لحل الأليلات المختلفة لـ TH01 من كل فرد. من هذا الاختبار ، يمكن أن تكون العينة هي نسل هذين الوالدين ، لكن استخدام المزيد من تقارير المعاملات المشبوهة سيجعلها أكثر تحديدًا. عد TCATs.


فئة 12 علم الأحياء الفصل 6 بصمات الحمض النووي

بصمة الحمض النووي هي تقنية تستخدم لتحديد الفرد من خلال عينة من ملفات تعريف الحمض النووي الخاصة به.
تم اختراع بصمة الحمض النووي في عام 1984 من قبل عالم الوراثة البريطاني السير أليك جيفريز.
أساس التحديد بواسطة تنميط الحمض النووي هو تعدد الأشكال. تُعرف هذه التسلسلات شديدة التباين من الحمض النووي باسم VNTRs (عدد متغير من التكرارات الترادفية) و STRs (التكرارات الترادفية القصيرة) غالبًا ما يشار إليها باسم السواتل الصغيرة والسواتل الدقيقة. هناك العديد من التسلسلات الصغيرة غير المشفرة والقابلة للتوريث من القواعد والتي تتكرر عدة مرات.

لكل فرد نمط فريد من الحمض النووي للأقمار الصناعية الصغيرة والأقمار الصناعية ، باستثناء التوائم المتماثلة أو التوائم أحادية الزيجوت. التوائم المتطابقة لها نفس التركيب الوراثي لأنها تتطور من نفس اللاقحة.

تُعرف بصمة الحمض النووي أيضًا باسم مسبار الحمض النووي ، وتنميط الحمض النووي ، وكتابة الحمض النووي ، وبصمات الأصابع الجينية ، وتعدد أشكال طول الجزء المقيد.
اضغط لتتعلم المزيد

خطوات بصمة الحمض النووي:

  1. عزل الحمض النووي
  2. هضم الحمض النووي عن طريق نوكلياز تقييد
  3. فصل شظايا الحمض النووي عن طريق الرحلان الكهربائي ،
  4. نقل (النشاف) لشظايا الحمض النووي المنفصلة إلى أغشية اصطناعية ، مثل النيتروسليلوز أو النايلون ، & # xA0
  5. التهجين باستخدام مسبار VNTR المسمى ، و
  6. الكشف عن شظايا الحمض النووي المهجن بواسطة التصوير الشعاعي الذاتي

استخراج الحمض النووي من الخلايا

يجب معالجة عينة تحتوي على مادة وراثية بمواد كيميائية مختلفة. تشمل أنواع العينات الشائعة المستخدمة اليوم مسحات الدم والخد.

يجب معالجة هذه العينات بسلسلة من المواد الكيميائية لكسر أغشية الخلايا المفتوحة ، وكشف عينة الحمض النووي ، وإزالة المكونات غير المرغوب فيها & # x2013 مثل الدهون والبروتينات & # x2013 حتى يظهر DNA نقي نسبيًا.

تضخيم PCR

إذا كانت كمية الحمض النووي في العينة صغيرة ، فقد يرغب العلماء في إجراء تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل PCR & # x2013 وتضخيم العينة.

العلاج بأنزيمات التقييد

أفضل الواسمات المستخدمة في تحديد سمات الحمض النووي بسرعة وسهولة هي تلك التي يمكن تحديدها بشكل موثوق باستخدام إنزيمات التقييد الشائعة ، ولكنها تختلف اختلافًا كبيرًا بين الأفراد.
لهذا الغرض ، يستخدم العلماء التسلسلات المتكررة وأجزاء # x2013 من الحمض النووي التي لها نفس التسلسل بحيث يمكن التعرف عليها بواسطة نفس إنزيمات التقييد ، ولكنها تتكرر عددًا مختلفًا من المرات في أشخاص مختلفين. تشمل أنواع التكرارات المستخدمة في توصيف الحمض النووي التكرارات الترادفية المتغيرة العدد (VNTRs) ، وخاصة التكرارات الترادفية القصيرة (STRs) ، والتي يشار إليها أيضًا من قبل العلماء باسم & # x201Cmicrosatellites & # x201D أو & # x201Cminisatellites. & # x201D

بمجرد عزل الحمض النووي الكافي وتضخيمه ، إذا لزم الأمر ، يجب قطعه باستخدام إنزيمات التقييد لعزل VNTRs. إنزيمات التقييد هي إنزيمات ترتبط بتسلسلات معينة من الحمض النووي وتخلق فواصل في خيوط الحمض النووي.
في الهندسة الوراثية ، يتم تقطيع الحمض النووي باستخدام إنزيمات تقييدية ثم & # x201Csewn & # x201D معًا بواسطة ligases لإنشاء تسلسلات جديدة من الحمض النووي المؤتلف. ومع ذلك ، في تحديد سمات الحمض النووي ، لا يلزم سوى جزء القطع. بمجرد قطع الحمض النووي لعزل VNTRs ، حان الوقت لتشغيل شظايا الحمض النووي الناتجة على مادة هلامية لمعرفة المدة التي تستغرقها.

هلام الكهربائي

الرحلان الكهربائي للهلام هو تقنية رائعة تفصل الجزيئات حسب الحجم. إن & # x201Cgel & # x201D المعنية هي مادة يمكن للجزيئات أن تمر من خلالها ، ولكن فقط بسرعة بطيئة.
مثلما تبطئ مقاومة الهواء شاحنة كبيرة أكثر مما تفعله دراجة نارية ، فإن المقاومة التي يوفرها هلام الرحلان الكهربائي تبطئ الجزيئات الكبيرة أكثر من الجزيئات الصغيرة. تأثير الهلام دقيق للغاية بحيث يمكن للعلماء معرفة حجم الجزيء بالضبط من خلال رؤية مدى تحركه داخل هلام معين في فترة زمنية محددة.
في هذه الحالة ، سيخبر قياس حجم أجزاء الحمض النووي من العينة التي تم علاجها بإنزيم تقييد للعلماء عدد النسخ من كل VTNR التي تكرر عينة الحمض النووي.
يسمى & # x2019 الرحلان الكهربائي & # x201D لأنه لجعل الجزيئات تتحرك عبر الهلام ، يتم تطبيق تيار كهربائي. نظرًا لأن العمود الفقري للسكر والفوسفات في الحمض النووي له شحنة كهربائية سالبة ، فإن التيار الكهربائي يسحب الحمض النووي معه عبر الهلام.
من خلال النظر في عدد أجزاء الحمض النووي التي تنتجها إنزيمات التقييد وأحجام هذه الأجزاء ، يمكن للعلماء & # x201Cfingerprint & # x201D المتبرع بالحمض النووي.

أداء اللطخة الجنوبية

الآن بعد أن تم فصل أجزاء الحمض النووي حسب الحجم ، يجب نقلها إلى وسيط حيث يمكن للعلماء & # x201Cread & # x201D وتسجيل نتائج الرحلان الكهربائي.
للقيام بذلك ، يقوم العلماء بمعالجة الهلام بحمض ضعيف ، والذي يكسر شظايا الحمض النووي إلى أحماض نووية فردية يمكن أن تتلاشى بسهولة على الورق. ثم يقومون بـ & # x201Cblot & # x201D شظايا الحمض النووي على ورق النيتروسليلوز ، مما يثبتهم في مكانهم.

العلاج بالمسبار المشع

الآن بعد أن تم تثبيت الحمض النووي على الورق النشاف ، يتم معالجته بمسبار كيميائي خاص يلتصق بشظايا الحمض النووي المرغوبة. هذه المادة الكيميائية مشعة ، مما يعني أنها ستنشئ سجلاً مرئيًا عند تعرضها لأوراق الأشعة السينية.
تم اكتشاف طريقة النشاف هذه لشظايا الحمض النووي على ورق النيتروسليلوز ثم معالجتها بمسبار مشع من قبل عالم يدعى Ed Southern & # x2013 ومن هنا جاء الاسم & # x201CSouthern blot. & # x201D
من المضحك أن حقيقة أن اللطخة الجنوبية سميت على اسم عالم وليس الاتجاه & # x201Csouth & # x201D لم تمنع العلماء من تسمية طرق مماثلة & # x201Cn Northern & # x201D و & # x201Cwestern & # x201D تكريما للطخة الجنوبية.

التعرض لفيلم الأشعة السينية

الخطوة الأخيرة من العملية هي تحويل المعلومات من أجزاء الحمض النووي إلى سجل مرئي. يتم ذلك عن طريق تعريض ورقة النشاف ، مع أشرطة الحمض النووي المشعة ، لفيلم الأشعة السينية.
تم تطوير فيلم الأشعة السينية & # x201C & # x201D بالإشعاع ، تمامًا مثل فيلم الكاميرا الذي تم تطويره بواسطة الضوء المرئي ، مما أدى إلى تسجيل مرئي للنمط الذي ينتجه الشخص & # x2019s DNA & # x201Cfingerprint. & # x201D
لضمان وجود بصمة واضحة ، غالبًا ما يترك العلماء فيلم الأشعة السينية مكشوفًا للورقة الجنوبية الإشعاعية الضعيفة لمدة يوم أو أكثر.
بمجرد تطوير الصورة وإصلاحها لمنع المزيد من التعرض للضوء من تغيير الصورة ، يمكن استخدام & # x201Cfingerprint & # x201D لتحديد ما إذا كانت عينتان من الحمض النووي متماثلتين أو متشابهتين.

تطبيقات البصمة DNA:

تُستخدم هذه العملية بشكل متكرر في الحالات التالية:

التحقيقات الجنائية لتحديد ما إذا كانت عينات الدم أو الأنسجة التي تم العثور عليها في مسرح الجريمة يمكن أن تنتمي إلى مشتبه به معين.

  • تطابق أنسجة المتبرعين بالأعضاء مع أنسجة الأشخاص الذين يحتاجون إلى عمليات زرع.
  • حدد الأمراض التي تنتقل عبر عائلتك.
  • ساعد في العثور على علاجات لتلك الأمراض ، والتي تسمى الحالات الوراثية.

في العلم ، تُستخدم بصمات الحمض النووي في قصة مجموعات النباتات والحيوانات لتحديد مدى ارتباط الأنواع والمجموعات ارتباطًا وثيقًا بالأنواع والمجموعات السكانية الأخرى. علاوة على ذلك ، يمكنه تتبع انتشارها بمرور الوقت. هذه القدرة على النظر مباشرة إلى الكائن الحي وعلامات الجينات # x2019s أحدثت ثورة في فهمنا لعلم الحيوان وعلم النبات والزراعة وحتى تاريخ البشرية.


أوجه التشابه بين VNTR و STR

  • VNTR و STR نوعان من التكرارات الترادفية.
  • كل من VNTR و STR هي مناطق هيكلية لجينوم حقيقيات النوى.
  • يتكون كل من VNTR و STR من DNA غير مشفر.
  • كلا VNTR و STR موروثة من الوالدين.
  • يتكون كل من VNTR و STR من متواليات متكررة ، مرتبة بجوار بعضها البعض في مصفوفة.
  • ينتج كل من VNTR و STR تعدد الأشكال الجيني.
  • ينتشر كل من VNTR و STR في جميع أنحاء الجينوم.
  • يتم استخدام كل من VNTR و STR كواسمات جينية في علم الوراثة الشرعي.
  • تؤدي الطفرات في كل من VNTR و STR إلى أمراض وراثية.

الاستنتاجات

حاولت الدراسة الحالية توضيح جوانب انتقال F. النفسية في شيلي والنرويج باستخدام VNTRs كواسمات جينية ، أي. نظام MLVA. أعطت الطريقة ، إلى حد كبير ، نفس القرار الموجود في دراسة سابقة لـ MLST Apablaza et al. [36] ، مع تنوع كبير بين العزلات التشيلية وتباين أقل بين العزلات النرويجية. لم تكن الطريقة قادرة على فصل العزلات فيما يتعلق بالأنواع المضيفة باستثناء مجموعة واحدة من العزلات المتميزة من سمك السلمون الأطلسي البري في النرويج. ليس من الواضح ما إذا كان هذا بسبب الدقة المحدودة للطريقة أو نتيجة لارتفاع ضغط العدوى بين التجمعات المصابة من السلمون الأطلسي وتراوت قوس قزح في تشيلي وأوروبا. يجب اختبار إمكانات تحليل VNTR كطريقة لفصل العزلات فيما يتعلق بالفوعة في تجارب التحدي باستخدام العزلات ذات الملامح المختلفة. بالإضافة إلى ذلك ، يجب أن تشمل الدراسة المستقبلية المزيد من العزلات من F. النفسية للحصول على دراسة أكثر تفصيلاً لقوة دقة الطريقتين ، تحليل MLST و VNTR.


تحديد خصائص الحمض النووي في الطب الشرعي الحديث (مع رسم بياني)

بصمات الحمض النووي هي المخبر الجيني الحالي في ممارسة الطب الشرعي الطبي الحديث. تم وصف المبادئ الأساسية لبصمات الحمض النووي بإيجاز. هيكل جينوم كل شخص فريد من نوعه. الاستثناء الوحيد هو التوائم المتماثلة أحادية الزيجوت (تم تطوير التوائم من بويضة مخصبة واحدة).

توفر الطبيعة الفريدة لبنية الجينوم فرصة جيدة لتحديد هوية الفرد. يمكن أن نتذكر هنا أنه في تقنية البصمة التقليدية ، يتم التعرف على الفرد من خلال إعداد انطباع بالحبر لطيات الجلد عند طرف إصبع الشخص & # 8217s. يعتمد هذا على حقيقة أن طبيعة طيات الجلد هذه محددة وراثيًا ، وبالتالي فإن بصمة الإصبع فريدة بالنسبة للفرد. في المقابل ، فإن بصمة الحمض النووي هي تحليل لتسلسل القاعدة النيتروجينية في الحمض النووي للفرد.

التاريخ والمصطلحات:

تم تطوير تقنية البصمة الأصلية للحمض النووي بواسطة Alec Jaffrey & # 8217s في عام 1985. على الرغم من استخدام بصمة الحمض النووي بشكل شائع ، يفضل استخدام مصطلح أكثر عمومية لتنميط الحمض النووي. هذا يرجع إلى حقيقة أنه يمكن إجراء مجموعة واسعة من الاختبارات عن طريق تسلسل الحمض النووي باستخدام تقنية محسنة.

تطبيقات بصمة الحمض النووي:

كمية الحمض النووي المطلوبة لبصمة الحمض النووي صغيرة بشكل ملحوظ. تكفي الكميات الدقيقة من الحمض النووي من سلالات الدم وسوائل الجسم وألياف الشعر أو شظايا الجلد. يستخدم تفاعل البلمرة المتسلسل لتضخيم هذا الحمض النووي لاستخدامه في بصمات الأصابع. تنميط الحمض النووي له مجموعة واسعة من التطبيقات - معظمها يتعلق بالطب الشرعي الطبي.

بعض العناصر المهمة مذكورة أدناه:

أنا. تحديد المجرمين والمغتصبين واللصوص وما إلى ذلك.

ثانيا. تسوية منازعات الأبوة.

ثالثا. استخدامها في قضايا الهجرة والنزاعات.

بشكل عام ، يتم تنفيذ تقنية البصمات عن طريق جمع الحمض النووي من المشتبه به (أو شخص في نزاع أبوة أو الهجرة) ومطابقته مع عينة مرجعية (من ضحية جريمة ، أو قريب مقرب في قضية مدنية).

علامات الحمض النووي في تشخيص الأمراض وبصمات الأصابع:

تعتبر علامات الحمض النووي مفيدة للغاية لرسم الخرائط الجينية للجينوم. هناك أربعة أنواع من تسلسلات الحمض النووي التي يمكن استخدامها كواسمات.

1. تقييد تعدد الأشكال طول القطعة (RFLFs ، وضوحا كما ريف الشفاه).

2. الأقمار الصناعية الصغيرة أو عدد متغير متكرر الترادف (VNTRs ، وضوحا مثل vinters).

3. السواتل الدقيقة أو التكرارات الترادفية البسيطة (STRs).

4. تعدد أشكال النوكليوتيدات المفردة (SNPs ، وضوحا على شكل قصاصات).

يتم وصف الجوانب العامة لواسمات الحمض النووي المذكورة أعلاه جنبًا إلى جنب مع فائدتها في تشخيص المرض وبصمة الحمض النووي.

تعدد الأشكال طول جزء التقييد (RFLPs):

يمثل RFLP امتدادًا للحمض النووي الذي يعمل كعلامة لرسم خرائط جين محدد. توجد RFLPs بشكل عشوائي في جميع كروموسومات الشخص وليس لها وظيفة ظاهرة. يمكن تقطيع جزيء الحمض النووي إلى أجزاء مختلفة بواسطة مجموعة من الإنزيمات تسمى نوكليازات التقييد ، وتسمى هذه الأجزاء تعدد الأشكال (تعني حرفياً العديد من الأشكال).

تم توضيح مخطط RFLP في الشكل 14.5. يحتوي جزيء الحمض النووي 1 على ثلاثة مواقع تقييد (R.1، ر2، ر3) ، وعندما تشق بواسطة نوكلياز تقييد تشكل 4 شظايا. دعونا الآن نفكر في الحمض النووي 2 مع طفرة وراثية (أو تغيير جيني) غيرت بعض أزواج القواعد. ونتيجة لذلك ، فإن الموقع (R2) للاعتراف عن طريق تقييد نوكلياز داخلي مفقود. يشكل جزيء الحمض النووي 2 هذا عند قطعه عن طريق نوكلياز داخلي 3 أجزاء فقط (بدلاً من 4 في الحمض النووي 1).

كما يتضح من الوصف أعلاه ، يوجد امتداد للحمض النووي في أجزاء من أطوال مختلفة (تعدد الأشكال) ، مشتق من عمل إنزيمات التقييد ، ومن هنا جاءت تعدد الأشكال في طول جزء تقييد الاسم.

RFLPs في تشخيص الأمراض:

إذا كان RFLP يقع داخل أو حتى بالقرب من مكان الجين الذي يسبب مرضًا معينًا ، فمن الممكن تتبع الجين المعيب عن طريق تحليل RFLP في الحمض النووي. يتم عزل الحمض النووي الخلوي للشخص & # 8217s ومعالجته بالأنزيمات المقيدة. يتم فصل أجزاء الحمض النووي التي تم الحصول عليها عن طريق الرحلان الكهربائي.

يمكن مقارنة أنماط RFLP للمرض المشتبه به مع الأشخاص العاديين (ويفضل أن يكون ذلك مع الأقارب في نفس العائلة). من خلال هذا النهج ، من الممكن تحديد ما إذا كان الفرد لديه علامة RFLP وجين المرض. مع 95٪ من اليقين ، يمكن لـ RFLPs اكتشاف الأمراض الجينية الفردية.

طرق تسجيل RFLP:

هناك طريقتان في الاستخدام الشائع لاكتشاف RFLPs (الشكل 14.5).

1. التهجين الجنوبي:

يتم هضم الحمض النووي باستخدام إنزيم التقييد المناسب ، وفصله عن طريق الرحلان الكهربائي لهلام الاغاروز. يتم نقل شظايا الحمض النووي التي تم الحصول عليها إلى غشاء نايلون. يتم الآن إضافة مسبار الحمض النووي الذي يمتد على موقع التقييد المشتبه به ، ويتم الكشف عن العصابات المهجنة بواسطة التصوير الشعاعي التلقائي. إذا كان موقع التقييد غائبًا ، فسيتم اكتشاف جزء تقييد واحد فقط. إذا كان الموقع موجودًا ، فسيتم اكتشاف شظيتين (الشكل 14.6 أ).

2. تفاعل البلمرة المتسلسل:

يمكن أيضًا تسجيل RFLPs بواسطة PCR. لهذا الغرض ، يتم استخدام بادئات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) التي يمكن أن تصلب على جانبي موقع التقييد المشتبه به. بعد التضخيم بواسطة PCR ، يتم معالجة جزيئات الحمض النووي بإنزيم تقييد ثم تحليلها بواسطة الاغاروز الكهربائي للهلام. في حالة عدم وجود موقع التقييد ، يتم رؤية نطاق واحد فقط بينما يتم العثور على نطاقين إذا تم العثور على الموقع (الشكل 14.6 ب).

تطبيقات RFLPs:

نهج RFLP قوي للغاية وساعد العديد من الجينات على رسم خرائط على الكروموسومات ، على سبيل المثال فقر الدم المنجلي (كروموسوم 11) ، التليف الكيسي (كروموسوم 7) ، مرض هنتنغتون و 8217 (كروموسوم 4) ، ورم أرومي شبكي (كروموسوم 13) ، مرض الزهايمر ومرض # 8217 (كروموسوم 21).

عدد متغير يتكرر جنبا إلى جنب (VNTRs):

VNTRs ، المعروفة أيضًا باسم الأقمار الصناعية الصغيرة ، مثل RFLPs ، هي أجزاء من الحمض النووي ذات أطوال مختلفة. يتمثل الاختلاف الرئيسي في أن RFLPs تتطور من طفرات عشوائية في موقع نشاط إنزيم التقييد بينما تتشكل VNTRs بسبب اختلاف عدد التسلسلات الأساسية بين نقطتين من جزيء DNA. بشكل عام ، تتكون VNTRs من تكرارات ترادفية لتسلسلات أساسية قصيرة (10-100 زوج أساسي). قد يختلف عدد العناصر في منطقة معينة ، ومن ثم تُعرف باسم تكرارات الأرقام المتغيرة الترادفية.

يحتوي جينوم الفرد & # 8217s على العديد من VNTRs و RFLPs الفريدة للفرد. يشكل نمط VNTRs و RFLPs أساس بصمات الحمض النووي أو توصيف الحمض النووي. في الشكل 14.7 ، يتم عرض جزيئين مختلفين من DNA مع عدد مختلف من النسخ (العصابات) من VNTRs. عندما تخضع هذه الجزيئات لتقييد عمل نوكلياز داخلي (في موقعين R 1 و ر2) ، يتم إصدار تسلسلات VNTR ، ويمكن اكتشافها بسبب التباين في نسخ تسلسل التكرار. يمكن استخدام هذه في رسم خرائط الجينوم ، إلى جانب فائدتها في بصمة الحمض النووي.

تعد VNTRs مفيدة للكشف عن أمراض وراثية معينة مرتبطة بالتغيرات في درجة تكرار السواتل الدقيقة على سبيل المثال رقص هنتنغتون & # 8217s هو اضطراب يظهر عندما تتجاوز VNTRs 40 وحدة متكررة.

العيب الرئيسي لـ VNTRs هو أنها ليست موزعة بالتساوي في جميع أنحاء الجينوم. تميل VNTRs إلى أن تكون مترجمة في مناطق التيلومير في نهايات الكروموسومات.

استخدام RFLPs و VNTRs في البصمات الجينية:

يمكن الكشف عن RFLPs الناتجة عن الاختلافات في عدد VNTRs بين موقعي تقييد (الشكل 14.8). يتم قطع الحمض النووي من ثلاثة أفراد مع VNTRs مختلفة بواسطة نوكلياز تقييد محدد. يتم فصل شظايا الحمض النووي عن طريق الرحلان الكهربائي ، ويتم تحديدها بعد التهجين بمسبار مكمل لتسلسل محدد على الشظايا.

السواتل الدقيقة (التكرارات الترادفية البسيطة):

السواتل المكروية عبارة عن وحدات متكررة قصيرة (10-30 نسخة) تتكون عادة من وحدات نيوكليوتيد أو رباعي نيوكليوتيد. هذه التكرارات الترادفية البسيطة (STRs) أكثر شيوعًا من الأقمار الصناعية الصغيرة (VNTRs) كعلامات DNA لسببين.

1. تنتشر السواتل المكروية في جميع أنحاء الجينوم.

2. يمكن استخدام PCR بشكل فعال وملائم لتحديد طول تعدد الأشكال.

تم توضيح متغيرين (أليلات) من جزيئات الحمض النووي مع 5 و 10 وحدات متكررة من نيوكليوتيدات ثنائيات (GA) في الشكل 14.9.

وباستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل ، يتم تضخيم المنطقة المحيطة بالسواتل المكروية ، وفصلها بواسطة الرحلان الكهربائي لهلام الاغاروز وتحديدها.

تعدد أشكال النوكليوتيدات المفردة (SNPs):

تمثل SNPs المواقف في الجينوم حيث يكون لدى بعض الأفراد نوكليوتيد واحد (مثل G) بينما يمتلك البعض الآخر نيوكليوتيدًا مختلفًا (على سبيل المثال C). توجد أعداد كبيرة من النيوكلوتايد في الجينوم. تشير التقديرات إلى أن الجينوم البشري يحتوي على ما لا يقل عن 3 ملايين تعدد الأشكال. قد تؤدي بعض هذه النيوكلوتايد إلى ظهور RFLPs. تعد SNPs مفيدة للغاية كواسمات للحمض النووي حيث لا توجد حاجة للهلام الكهربائي وهذا يوفر الكثير من الوقت والجهد. يعتمد اكتشاف تعدد النيوكليوتيدات على تحليل تهجين قليل النوكليوتيد (الشكل 14.10).

قليل النوكليوتيد هو جزيء DNA قصير أحادي الخيط يتم تصنيعه في المختبر بطول لا يتجاوز عادة 50 نيوكليوتيد. في ظل الظروف المناسبة ، سيتم تهجين تسلسل النوكليوتيدات هذا مع خيط DNA مستهدف إذا كان كلاهما له بنية زوجية قاعدية تمامًا. حتى عدم التطابق الفردي في الزوج الأساسي لن يسمح بحدوث التهجين. تُستخدم تقنية شرائح الحمض النووي بشكل شائع لفحص تهجين النيوكلوتايد مع قليل النوكليوتيد

التكنولوجيا الحالية لبصمة الحمض النووي:

في تحليل الطب الشرعي للحمض النووي ، يتم الآن استبدال التقنيات الأصلية المستندة إلى RFLPs و VNTRs إلى حد كبير بالسواتل المكروية (التكرارات الترادفية القصيرة). يتضمن المبدأ الأساسي تضخيم السواتل المكروية عن طريق تفاعل البلمرة المتسلسل متبوعًا باكتشافها. أصبح من الممكن الآن إنشاء ملف تعريف الحمض النووي عن طريق نظام الكشف الآلي للحمض النووي (يمكن مقارنته بمعدات تسلسل الحمض النووي).


كيف يتم استخدام VNTRs في توصيف الحمض النووي؟

انقر هنا لمعرفة المزيد عنها. وفقًا لذلك ، لماذا يمكن استخدام VNTRs في تحديد الهوية الشخصية؟

في هذا الطريق، VNTRs هي مصدر واحد لتعدد الأشكال الجيني (الاختلاف) ، و علبة يكون تستخدم كعلامات لـ هوية شخصية وكذلك في دراسة الوراثة والتنوع الجيني وعلم الوراثة السكانية والاضطرابات الوراثية.

أيضًا ، هل توجد VNTRs داخل الجينات؟ عدد متغير يتكرر جنبا إلى جنب / VNTRs VNTR. داخل جين ، تسلسلات قصيرة من الحمض النووي تتكرر جنبًا إلى جنب والتي تختلف اختلافًا كبيرًا في العدد بين الأفراد وتسمى أيضًا السواتل المكروية. يشيع استخدامها في بصمة الحمض النووي بسبب التباين الشديد بين البشر المختصرة كـ VNTRs.

إذن ، كيف تُستخدم تقارير المعاملات المشبوهة في توصيف الحمض النووي؟

نظام استخدام تنميط الحمض النووي اليوم يعتمد على PCR ويستخدم تسلسلات بسيطة أو يتكرر الترادف القصير (STR). يتم استهداف مواقع STR هذه (المواقع الموجودة على الكروموسوم) باستخدام بادئات خاصة بالتسلسل وتضخيمها باستخدام PCR. ال الحمض النووي يتم بعد ذلك فصل الشظايا الناتجة واكتشافها باستخدام الرحلان الكهربي.

متغير عدد يتكرر جنبا إلى جنب (VNTRs) تم استخدام فئتين مهمتين من التكرار الترادفي على نطاق واسع في علم الوراثة الشرعي: السواتل الصغيرة ، والتي يشار إليها أيضًا باسم التكرارات الترادفية ذات الأرقام المتغيرة (VNTRs) والسواتل المكروية ، والتي يشار إليها أيضًا باسم التكرارات الترادفية القصيرة (تقارير المعاملات المشبوهة).


RFLPs ، VNTR ، SNP - التعاريف والاستخدام

ما هي تعدد الأشكال لطول جزء التقييد (RFLPs) ، التكرار الترادفي للعدد المتغير (VNTRs) ، وتعدد أشكال النوكليوتيدات المفردة (SNPs)؟ ما هي العلاقة بين هؤلاء؟ كيف نستخدم هذه التكنولوجيا ، على سبيل المثال ، لتحديد الأبوة؟

© BrainMass Inc. brainmass.com 4 مارس 2021 ، 11:20 مساءً ad1c9bdddf
https://brainmass.com/biology/dna-chromosomes-and-genomes/rflps-vntr-snp-definitions-413525

معاينة الحل

RFLP لتقف على طول جزء تقييد تعدد الأشكال. تعتمد هذه التقنية على حقيقة أنه عند هضمها عن طريق إنزيمات تقييدية ، سيتم إنشاء نمط من أجزاء الحمض النووي من الحمض النووي للفرد الذي يكون فريدًا بسبب التسلسل الفريد للحمض النووي الخاص به. من خلال فحص نمط النطاقات لهذا الحمض النووي الذي يعمل على مادة هلامية ، يمكن تحديد هوية الأليلات المعينة من خلال نمط النطاقات.

ترمز VNTR إلى عدد متغير من التكرارات الترادفية. يعتمد تحليل VNTRs على حقيقة وجود مناطق على العديد من الكروموسومات حيث توجد.

ملخص الحل

يشرح هذا الحل ما هو المقصود بتعدد الأشكال لطول جزء التقييد (RFLP) ، التكرار الترادفي للعدد المتغير (VNTR) ، وتحليل تعدد أشكال النوكليوتيدات الفردي (SNP). كما يفصل العلاقات بينها وكيفية استخدامها.


استخدام نوكليازات التقييد لتحليل التكرارات الترادفية المتغيرة العدد (VNTRs) - علم الأحياء

الجزء الثالث. البيولوجيا الجزيئية ، والتقسيم الخلوي ، والجينات

11. تطبيقات التكنولوجيا الحيوية

11.2. مقارنة الحمض النووي

من المفيد التمييز بين الكائنات الحية الفردية على أساس حمضها النووي. يمكن إجراء مقارنات الحمض النووي بطريقتين عامتين. يعتمد كلاهما على حقيقة أن الكائنات الحية المختلفة وراثيًا سيكون لها تسلسلات نيوكليوتيدات مختلفة في حمضها النووي. الطريقتان هما بصمة الحمض النووي وتسلسل الحمض النووي. تبحث بصمات الحمض النووي في الأنماط في أجزاء معينة من الحمض النووي للكائن الحي. ينظر تسلسل الحمض النووي مباشرة إلى تسلسل النوكليوتيدات.

نظرًا لأن كلا النهجين لهما مزايا وعيوب ، يختار العلماء بينهما وفقًا لاحتياجاتهم. تسمح بصمة الحمض النووي بإلقاء نظرة سريعة نسبيًا على مناطق أكبر من المعلومات الجينية للكائن الحي. من المفيد التمييز بين الكائنات الحية - مثل المشتبه بهم المحتملين في محاكمة المحكمة. يخلق تسلسل الحمض النووي نظرة مفصلة للغاية على منطقة صغيرة نسبيًا من المعلومات الجينية للكائن الحي. تسلسل الحمض النووي هو المظهر الأكثر تفصيلاً الذي يمكننا الحصول عليه من المعلومات الجينية للكائن الحي.

بصمة الحمض النووي هي تقنية تحدد الأفراد بشكل فريد على أساس قطع قصيرة من الحمض النووي. نظرًا لعدم وجود شخصين لهما نفس تسلسل النيوكليوتيدات ، فإنهما لا يولدان نفس أطوال أجزاء الحمض النووي عندما يتم قطع الحمض النووي الخاص بهما باستخدام الإنزيمات. حتى النظر إلى العديد من قطع الحمض النووي التي يتم إنتاجها بهذه الطريقة أمر معقد للغاية. Therefore, scientists don’t look at all the possible fragments but, rather, focus on differences found in pieces of DNA that form repeating patterns in the DNA. By focusing on these regions with repeating nucleotide sequences, it is possible to determine whether samples from two individuals have the same number of repeating segments (Outlooks 11.1).

The First Use of a DNA Fingerprint in a Criminal Case

In 1988, a baker in England was the first person in the world to be convicted of a crime on the basis of DNA evidence. Colin Pitchfork's crime was the rape and murder of two girls. The first murder occurred in 1983. The initial evidence in this case consisted of the culprit's body fluids, which contained his proteins and DNA. On the basis of the proteins, the police were able to create a molecular description of the culprit. The problem was that this description matched 10% of the males in the local population, and the police were unable to identify just one person. In 1986, there was another murder that closely matched the details of the 1983 killing. Another male, Richard Buckland, was the prime suspect for the second murder. In fact, while being questioned, Buckland admitted to the most recent killing but had no knowledge of the first killing. The clues still did not point consistently to a single person.

Meanwhile, the scientists at a nearby university had been working on a new forensic technique—DNA fingerprinting.

To track down the killer, police asked local men to donate blood or saliva samples. Between 4,000 and 5,000 local men participated in the dragnet. None of the volunteers matched the culprit's DNA. Interestingly, Buckland's DNA did not match the culprit's DNA, either. He was later released because his confession was false. It wasn't until after someone reported that Colin Pitchfork had asked a friend to donate a sample for him and offered to pay several others to do the same that police arrested Pitchfork. Pitchfork's DNA matched that of the killer's.

This is a good example of how biotechnology helps the search for truth within the justice system. The additional evidence from DNA was able to provide key information to identify the culprit.

DNA Fingerprinting Techniques

In the scenario presented in Outlooks 11.1, a crime was committed and the scientists had evidence in the form of body fluids from the criminal. These body fluids contained cells with the criminal’s DNA. The DNA in these cells was used as a template to produce enough DNA for analysis. The polymerase chain reaction (PCR) is a technique used to generate large quantities of DNA from small amounts (How Science Works 11.1).

Using PCR and the suspect’s DNA, scientists were able to replicate regions of human DNA that are known to vary from individual to individual. This created large quantities of DNA so that DNA fingerprinting could be performed. Scientists target areas of the suspect’s DNA that contains variable number tandem repeats. Variable number tandem repeats (VNTRs) are sequences of DNA that are repeated a variable number of times from one individual to another. For example, in a given region of DNA, one person may have a DNA sequence repeated 4 times, whereas another may have the same sequence repeated 20 times (figure 11.1).

FIGURE 11.1. Variable Number Tandem Repeats

Variable number tandem repeats (VNTRs) are short sequences of DNA that are repeated often. The repeated sequences are attached end-to-end. This illustration shows the VNTRs for three individuals. The individual in I has 8 repeats on 1 chromosome and 12 on the homologous chromosome. They are heterozygous. The individual in II is homozygous for 12 repeats. The individual in III is heterozygous for a different number of repeats—18 and 20.

Once enough DNA was generated through PCR, the DNA needed to be treated so that the VNTRs would be detectable. To detect the varying number of VNTRs, the replicated DNA sample is cut into smaller pieces with restriction enzymes. Restriction sites are DNA nucleotide sequences that attract restriction enzymes. When the restriction enzymes bind to a restriction site, the enzyme cuts the DNA molecule into two molecules. Restriction fragments are the smaller DNA fragments that are generated after the restriction enzyme has cut the selected DNA into smaller pieces. Some of the fragments of DNA that are generated by restriction enzymes will contain the regions with VNTRs. The fragments with VNTRs will vary in size from person to person because some individuals have more repeats than others. Restriction enzymes are used to create fragments of DNA that might be different from one individual to the next.

In DNA fingerprinting, scientists look for different lengths of restriction fragments as an indicator of differences in VNTRs.

Electrophoresis is a technique that separates DNA fragments on the basis of size (How Science Works 11.2). The shorter DNA molecules migrate more quickly than the long molecules. As differently sized molecules are separated, a banding pattern is generated. Each band is a differently sized restriction fragment. Each person’s unique DNA banding pattern is called a DNA fingerprint (figure 11.2). The process of DNA fingerprinting includes the following basic stages:

1. DNA is obtained from a source, which may be as small as one cell.

2. PCR is used to make many copies of portions of the DNA that contain VNTRs.

3. Restriction enzymes are used to cut the VNTR DNA into pieces so that the VNTRs can be detected.

4. To detect the differences in the VNTRs, the pieces are separated by electrophoresis.

5. Comparisons between patterns can be made.

FIGURE 11.2. DNA Fingerprints

(a) Because every person’s DNA is unique, (b) when samples of an individual’s DNA are collected and subjected to restriction enzymes, the cuts occur in different places and DNA fragments of different sizes result. (c) Restriction enzymes can cut DNA at places where specific sequences of nucleotides occur. (d) When the cut DNA fragments are separated by electrophoresis, (e) the smaller fragments migrate more quickly than the larger fragments. This produces a pattern, called a DNA fingerprint, that is unique and identifies the person who provided the DNA. (f) The victim’s DNA is on the left. The rapist’s DNA is in the middle. The suspect’s DNA is on the right. The match in banding patterns between the suspect and the rapist indicates that they are the same.

DNA Fingerprinting Applications

With DNA fingerprinting, the more similar the banding patterns are from two different samples, the more likely the two samples are from the same person. The less similar the patterns, the less likely the two samples are from the same person. In criminal cases, DNA samples from the crime site can be compared with those taken from suspects. If 100% of the banding pattern matches, it is highly probable that the suspect was at the scene of the crime and is the guilty party. The same procedure can be used to confirm a person’s identity, as in cases of amnesia, murder, or accidental death.

DNA fingerprinting can be used in paternity cases that determine the biological father of a child. A child’s DNA is a unique combination of both the mother’s DNA and the father’s DNA. The child’s DNA fingerprint is unique, but all the bands in the child’s DNA fingerprint should be found in either the mother’s or the father’s fingerprint. To determine paternity, the child’s DNA, the mother’s DNA, and DNA from the man who is alleged to be the father are collected.

The DNA from all three is subjected to PCR, restriction enzymes, and electrophoresis. During analysis of the banding patterns, scientists account for the child’s banding pattern by linking each DNA band to a DNA band of the mother and the presumed father. Bands that are common to both the biological mother and the child are identified and eliminated from further consideration. If all the remaining bands can be matched to the presumed father, it is extremely likely that he is the father (figure 11.3). If there are bands that do not match the presumed father’s, then there are one of two conclusions: (1) The presumed father is not the child’s biological father, or (2) the child has a new mutation that accounts for the unique band. This last possibility can usually be ruled out by considering multiple regions of DNA, because it is extremely unlikely that the child will have multiple new mutations.

FIGURE 11.3. Paternity Determination

(a) This illustration shows the VNTRs for four different individuals—a child, the mother, one possible father, and a second possible father. (b) Using PCR, electrophoresis, and DNA fingerprinting analysis, it is possible to identify the child’s father. The mother possesses the “12” band and has passed that to her child. The mother did not give the child the child’s “8” band because the mother does not have an “8” band herself. The child’s “8” band must have come from the father. Of the two men under consideration, only man IV has the “8” band, so man IV is the father. Now stop for a moment and think about the principles of genetics. If man IV is the father, why doesn’t the child have an “18” band?

Polymerase Chain Reaction

Polymerase chain reaction (PCR) is a laboratory procedure for copying selected segments of DNA from larger DNA molecules. With PCR, a single cell can provide enough DNA for analysis and identification. Scientists start with a sample of DNA that contains the desired DNA region. The types of samples that can be used include semen, hair, blood, bacteria, protozoa, viruses, mummified tissues, and frozen cells. Targeting specific portions of DNA for replication enables biochemists to manipulate DNA more easily. When many copies of this DNA have been produced it is easy to find, recognize, and manipulate.

PCR is a test-tube version of the cellular DNA replication process and requires similar components. The DNA from the sample specimen serves as the template for replication. Free DNA nucleotides are used to assemble new strands of DNA. DNA polymerase, which has been purified from bacteria cells, is used to catalyze the PCR reaction.

DNA primers are short stretches of single-stranded DNA, which are used to direct the DNA polymerase to replicate only certain regions of the template DNA. These primer molecules are specifically designed to flank the ends of the target region's DNA sequence and point the DNA polymerase to the region between the primers. The PCR reaction is carried out by heating the target DNA, so that the two strands of DNA fall away from each other. This process is called denaturation. Once the nitrogenous bases on the target sequence are exposed and the reaction cools, the primers are able to attach to the template molecule. The primers anneal to the template. The primers anneal (that is, stick or attach) to the template. The primers are able to target a particular area of DNA because the primer nucleotide sequence pairs with the template DNA sequence using the base-pairing rules.

Purified DNA polymerase is the enzyme that drives the DNA replication process. The presence of the primer, attached to the DNA template and added nucleotides, serves as the substrate for the DNA polymerase. Once added, the polymerase extends the DNA molecule from the primer down the length of the DNA. Extension continues until the polymerase falls off of the template DNA. The enzyme incorporates the new DNA nucleotides in the growing DNA strand. It stops when it reaches the other end, having produced a new copy of the target sequence.

The elegance of PCR is that it allows the exponential replication of DNA. Exponential, or logarithmic, growth is a doubling in number with each round of PCR. With just one copy of template DNA, there will be a total of two copies at the end of one replication cycle. During the second round, both copies are used as a template. At the end of the second round, there is a total of 4 copies. The number of copies of the target DNA increases very quickly. With each round of replication, the number doubles—8, 16, 32, 64. Each round of replication takes only minutes. Thirty rounds of replication in PCR can be performed within 2.5 hours. Starting with just one copy of DNA and 30 rounds of replication, it is possible to produce over half a billion copies of the desired DNA segment.

Because this technique can create useful amounts of DNA from very limited amounts, it is a very sensitive test for the presence of specific DNA sequences. Frequently, the presence of a DNA sequence indicates the presence of an infectious agent or a disease-causing condition.

During cycle one of PCR, the template DNA is denatured, so that the two strands of DNA separate. This allows the primers to attach (anneal) to the template DNA. DNA polymerase and DNA nucleotides, which are present for the reaction, create DNA by extending from the primers. During cycle 2, the same process occurs again, but the previous round of replication has made more template available for further replication. Each subsequent cycle essentially doubles the amount of DNA.

Electrophoresis is a technique used to separate molecules, such as nucleic acids, proteins, or carbohydrates. Electrophoresis separates nucleic acids on the basis of size. DNA is too long for scientists to work with when taken directly from the cell. To make the DNA more manageable, scientists cut the DNA into smaller pieces. Restriction enzymes are frequently used to cut large DNA molecules into smaller pieces. After the DNA is broken into smaller pieces, electrophoresis is used to separate differently sized DNA fragments.

Electrophoresis uses an electric current to move DNA through a gel matrix. DNA has a negative charge because of the phosphates that link the nucleotides. In an electrical field, DNA migrates toward the positive pole. The speed at which DNA moves through the gel depends on the length of the DNA molecule. Longer DNA molecules move more slowly through the gel matrix than do shorter DNA molecules.

When scientists work with small areas of DNA, electrophoresis allows them to isolate specific stretches of DNA for other applications.

DNA sequencing uses electrophoresis to separate DNA fragments of different lengths. A DNA synthesis reaction is set up that includes DNA from the region being investigated. The reaction also includes (1) DNA polymerase, (2) a specific DNA primer, (3) all DNA nucleotides (G, A, T, and C), and (4) a small amount of 4 kinds of chemically altered DNA nucleotides. DNA polymerase is the enzyme that synthesizes DNA in cells by using DNA nucleotides as a substrate. The DNA primer gives the DNA polymerase a single place to start the DNA synthesis reaction. All of these components work together to allow DNA synthesis in a manner very similar to cellular DNA replication.

The DNA sequencing process also adds nucleotides that have been chemically altered in two ways: (1) The altered nucleotides are called dideoxyribonucleosides because they contain a dideoxyribose sugar rather than the normal deoxyribose. Dideoxyribose has one less oxygen in its structure than deoxyribose. (2) The four kinds of dideoxyribonucleotides (A, T, G, C) are each labeled with a different flourescent dye so that each of the four nucleotides is colored differently. During DNA sequencing, the DNA polymerase randomly incorporates either a normal DNA nucleotide or a dideoxyribonucleotide. When the dideoxyribonucleoside is used, two things happen: (1) No more nucleotides can be added to the DNA strand, and (2) the DNA strand is now tagged with the fluorescent label of the dideoxynucleotide that was just incorporated.

As a group, the DNA molecules that are created by this technique have the following properties:

1. They all start at the same point, because they all started with the same primer.

2. There are copies of DNA molecules that had their replication halted at each nucleotide in the sequence of the sample DNA when a dideoxyribose nucleotide was incorporated.

3. DNA molecules of the same length (number of nucleotides) are labeled with the same color of fluorescent dye.

Electrophoresis separates this collection of molecules by size, because the shortest DNA molecules move fastest. The DNA sequence is determined by reading the color sequence from the shortest DNA molecules to the longest DNA molecules. The pattern of colors matches the order of the nucleotides in the DNA. The color pattern that is generated by the sequencing gel is the order of the nucleotides. Automated sequencing is done by using a laser beam to read the colored bands. A printout is provided as peaks of color to show the order of the nucleotides.

Gene Sequencing and the Human Genome Project

The Human Genome Project (HGP) was a 13-year effort to determine the human DNA sequence. Work began in 1990. It was first proposed in 1986 by the U.S. Department of Energy (DOE) and was cosponsored soon after by the National Institutes of Health (NIH). These agencies were the main research agencies within the U.S. government responsible for developing and planning the project. Estimates are that the United States spent over $3 billion on the Human Genome Project.

Many countries contributed both funds and labor resources to the Human Genome Project. At least 17 countries other than the United States participated, including Australia, Brazil, Canada, China, Denmark, France, Germany, Israel, Italy, Japan, Korea, Mexico, the Netherlands, Russia, Sweden, and the United Kingdom. The Human Genome Project was one of the most ambitious projects ever undertaken in the biological sciences.

The data that these countries produced are stored in powerful computers, so that the information can be shared. To get an idea of the size of this project, consider that a human Y chromosome (one of the smallest of the human chromosomes) is composed of nearly 60 million paired nucleotides. The larger X chromosome may be composed of 150 million paired nucleotides. The entire human genome consists of 3.12 billion paired nucleotides. That is roughly the same number as all the letter characters found in about 2,000 copies of this textbook.

Human Genome Project Techniques

Two kinds of work progressed simultaneously to determine the sequence of the human genome. First, physical maps were constructed by determining the location of specific “markers” and the proximity of these markers to genes. The markers were known sequences of DNA that could be located on the chromosome. This physical map was used to organize the vast amount of data produced by the second technique, which was for the labs to determine the exact order of nitrogenous bases of the DNA for each chromosome. Techniques exist for determining base sequences (How Science Works 11.3). The challenge is storing and organizing the information from these experiments, so that the data can be used.

A slightly different approach was adopted by Celera Genomics, a private U.S. corporation. Although Celera Genomics started later than the labs funded by the Department of Energy and National Institute of Health it was able to catch up and completed its sequencing at almost the same time as the government-sponsored programs by developing new techniques. Celera jumped directly to determining the DNA sequence of small pieces of DNA without the physical map. It then used computers to compare and contrast the short sequences, so that it could put them together and assemble the longer sequence. The benefit of having these two organizations as competitors was that, when they finished their research, they could compare and contrast results. Amazingly, the discrepancies between their findings were declared insignificant.

Human Genome Project Applications

The first draft of the human genome was completed early in 2003, when the complete nucleotide sequence of all 23 pairs of human chromosomes was determined. By sequencing the human genome, it is as if we have now identified all the words in the human gene “dictionary.” Continued analysis will provide the definitions for these words—what these words tell the cell to do.

The information provided by the human genome project is extremely useful in diagnosing diseases and providing genetic counseling to those considering having children. This information can identify human genes and proteins that can be targets for drugs and new gene therapies. Once it is known where an abnormal gene is located and how it differs in base sequence from the normal DNA sequence, steps could be taken to correct the abnormality. Further defining the human genome will also result in the discovery of new families of proteins and will help explain basic physiological and cell biological processes common to many organisms. All this information will increase the breadth and depth of the understanding of basic biology.

It was originally estimated that there were between 100,000 and 140,000 genes in the human genome, because scientists were able to detect so many different proteins. DNA sequencing data indicate that there are only about 20,000 protein-coding genes—only about twice as many as in a worm or a fly. Our genes are able to generate several different proteins per gene because of alternative splicing (figure 11.4). Alternative splicing occurs much more frequently than previously expected. Knowing this information provides insights into the evolution of humans and will make future efforts to work with the genome through bioengineering much easier.

FIGURE 11.4. Different Proteins—One Gene

This illustration shows a stretch of DNA that contains a gene. Proteincoding regions (exons) of this gene are shown in different colors. Introns that do not code for protein and are not transcribed into RNA are shown in a single color—rust. Alternative splicing allows different tissue to use the same gene but make slightly different proteins. The gray bands show how some exons are used to form both proteins, whereas other exons are used on only one protein.

There is a concern that, as our genetic makeup becomes easier to determine, some people may attempt to use this information for profit or political power. Consider that some health insurance companies refuse to insure people with “preexisting conditions” or those at “genetic risk” for certain abnormalities. Refusing to provide coverage would save these companies the expense of future medical bills incurred by “less than perfect” people. While this might be good for insurance companies, it raises major social questions about fair and equal treatment and discrimination.

Another fear is that attempts may be made to “breed out” certain genes and people from the human population to create a “perfect race.” Intentions such as these superficially appear to have good intentions, but historically they have been used by many groups to justify discrimination against groups of individuals or even to commit genocide.

While some scientists refine our understanding of the human genome, others are sequencing the genomes of other organisms. Representatives of each major grouping of organisms have been investigated, and the DNA sequence data have been made available to the general public through a centralized government website. This centralized database has made the exchange and analysis of scientific information easier than ever (table 11.1). The information gained from these studies

TABLE 11.1. Completed and Current Genome Projects

The Human Genome Project has sparked major interest in nonhuman genomes. The investigation of some genomes has been very organized. Other investigations have been less directed, whereby only sequences of certain regions of interest have been reported. Regardless, information on many genomes is available at the National Center for Biotechnology Information website.

Number of Different Genomes Represented

Viruses and retroviruses and bacteriphages

Herpes virus, human papillomavirus, HIV

Anthrax species, Chlamydia species, Escherichia coli, Pseudomonas species, Salmonella species

Halobacterium species, Methanococcus species, Pyrococcus species, Thermococcus species

Cryptosporidium species, Entamoeba histolytica, Plasmodium species

Yeast, Aspergillus, Candida

Thale cress (Arabidopsis thaliana), tomato, lotus, rice

Bee, cat, chicken, chimp, cow, dog, frog, fruit fly, mosquito, nematode, pig, rat, sea urchin, sheep, zebra fish

Patterns in Protein-Coding Sequences

As scientists sequenced the human genome and compared it with other genomes, certain patterns became apparent.

Tandem clusters are grouped copies of the same gene that are found on the same chromosome (figure 11.5). For example, the DNA that codes for ribosomal RNA is present in many copies in the human genome. From an evolutionary perspective, the advantage to the cell is the ability to create large amounts of gene product quickly from the genes found in tandem clusters.

FIGURE 11.5. Patterns in Protein Coding Sequences

(a) Tandem clusters are identical or nearly identical repeats of one gene. (b) Segmental duplications are duplications of sets of genes. These may occur on the same chromosome or different chromosomes. (c) Multigene families are repeats of similar genes. The genes are similar because regions are conserved from gene to gene, but many regions have changed significantly.

Segmental duplications are groups of genes that are copied from 1 chromosome and moved as a set to another chromosome. These types of gene duplications allow for genetic backups of information. If either copy is mutated, the remaining copy can still provide the necessary gene product sufficient for the organism to live. Because the function of the mutated copy of the gene is being carried out by the normal gene, the mutated copy may take on new function if it accumulates additional mutations. This can allow evolution to occur more quickly (figure 11.5b).

Multigene families are groups of different genes that are closely related. When members of multigene families are closely inspected, it is clear that certain regions of the genes carry similar nucleotide sequences. Hemoglobin is a member of the globin gene family. There are several different hemoglobin genes in the human genome. Evolutionary patterns can be tracked at the molecular level by examining gene families across species. The portions of genes that show very little change across many species represent portions of the protein that are important for function. Scientists reason that regions that are important for function will be intolerant of change and stay unaltered over time. Again, using hemoglobin as an example, it is possible to compare the hemoglobin genes of different organisms to identify specific changes in the gene. Such comparisons can lead to a better understanding of how organisms are related to each other evolutionarily (figure 11.5c).

The following are a few more interesting facts obtained by comparing genomes:

• Eukaryotic genomes are more complex than prokaryotic genomes. Eukaryotic genomes are, on average, nearly twice the size of prokaryotic genomes. Eukaryotic genomes devote more DNA to regulating gene expression. Only 1% of human DNA actually codes for protein.

• The number of genes in a genome is not a reflection of the size or complexity of an organism. Humans possess roughly 21,000 genes. Roundworms have about 26,000 genes, and rice plants possess 32,000 to 55,000 genes.

• Eukaryotes create multiple proteins from their genes because of alternative splicing. Prokaryotes do not. Nearly 25% of human DNA consists of intron sequences, which are removed during splicing. On average, each human gene makes between 4.5 and 5 different proteins because of alternative splicing.

• There are numerous, virtually identical genes found in very distantly related organisms—for example, mice, humans, and yeasts.

• Hundreds of genes found in humans and other eukaryotic organisms appear to have resulted from the transfer of genes from bacteria to eukaryotes at some point in eukaryotic evolution.

• Chimpanzees have 98-99% of the same DNA sequence as humans. All the human “races” are about 99.9% identical at the DNA level. In fact, there is virtually no scientific reason for the concept of “race,” because the amount of variation within a race is as great as the amount of variation between races.

• Genes are unequally distributed between chromosomes and unequally distributed along the length of a chromosome.

Patterns in Non-Coding Sequence

Protein-coding DNA is not the only reason for examining DNA sequences. The regions of DNA that do not code for protein are more important than once thought. Many noncoding sequences are involved with the regulation of gene expression.

A recent and more accurate map of the human genome from Britain focuses on copy number variations, or CNVs. These are segments in the genetic code that can be deleted or copied most are deletions and a small number are duplications. The new map has also revealed that humans have:

1. 75 “jumping genes,” or transposable elements (regions of the genetic code that can move from one place to another in the genome of an individual).

2. more than 250 genes that can lose one of the two copies in chromosomes and not causing any obvious consequences, and

3. 56 genes that can join together, potentially forming new genes.

The ability to make comparisons of the DNA of organisms has led to the development of three new fields in biology— genomics, transcriptomics, and proteomics. Genomics is the comparison of the genomes of different organisms to identify similarities and differences. Species relatedness and gene similarities can be determined from these studies. When the DNA sequence of a gene is known, transcriptomics looks at when, where, and how much mRNA is expressed from a gene. Finally, proteomics examines the proteins that are predicted from the DNA sequence. From these types of studies, scientists are able to identify gene families that can be used to determine how humans have evolved at a molecular level. They can also examine how genes are used in an organism throughout its body and over its life span. They can also better understand how a protein works by identifying common themes from one protein to the next.

3. What types of questions can be answered by comparing the DNA of two different organisms?

4. What techniques do scientists use to compare DNA?

5. What benefits does the Human Genome Project offer?

6. What is the purpose of the PCR?

7. What role does electrophoresis play in DNA comparisons?

8. What are tandem clusters, segmental duplications and multigene families?

If you are the copyright holder of any material contained on our site and intend to remove it, please contact our site administrator for approval.


نقاش

In this study we analyzed the temporal MIRU VNTR genotype stability in M. tuberculosis by using serial isolates from patients chronically infected over long periods (up to 6 years) within a defined high-incidence geographic area. The 12 MIRU VNTR loci were identical within groups of serial isolates in 55 out of 56 cases (98.2%). The total set of 123 isolates included both drug-sensitive and drug-resistant strains from a range of 20 distinct genotype families as previously defined by IS6110 RFLP fingerprints (33). The strains contained 2 to 24 IS6110 bands. The 12 MIRU VNTR loci thus appear to be highly stable over a period as long as 6 years, within a large range of strain lineages and genetic backgrounds.

Even the 11 paired isolates with slightly different IS6110 RFLPs all displayed conserved MIRU VNTR genotypes. However, in one case serial isolates with an unchanged IS6110 RFLP pattern showed a change in the MIRU VNTR genotype, which was limited to 1 out of the 12 loci. Interestingly, this locus (locus 26) is one of the most polymorphic MIRU VNTR loci in M. tuberculosis strains, suggesting that its molecular clock is faster than those of the other loci (16, 26). The change in this locus consisted of a single repeat difference. Such a change is consistent with a stepwise VNTR mutation mechanism (sequential additions or deletions of repeat units), supported by a previous analysis of MIRU VNTR changes in locus 4 in the Mycobacterium bovis BCG genealogy (28). It should be noted that these isolates were separated by 309 days, which is far less than the time spans between many other first and last isolates (up to 2,185 days) during which MIRU VNTR genotypes were stable. Thus, this change is best interpreted by stochastic occurrence of a VNTR mutation event concomitant to emergence of a corresponding clonal variant in the bacterial population in the second isolation.

In agreement with previous studies (16, 26, 28), these results provide additional evidence that the mechanisms driving MIRU VNTR and IS6110 RFLP pattern polymorphisms are essentially independent from one another and that the combined evolution rate of the 12 MIRU VNTR loci is slightly lower than that of IS6110 RFLP. Therefore, the MIRU VNTRs appear suitable for reliable follow-up of patients chronically infected with M. tuberculosis over long periods. On the basis of the stability of MIRUs, the detection of changes in MIRU VNTR genotypes will help to clarify the definition of exogenous reinfection, which is currently based on observation of changes of at least three or four bands in IS6110 RFLP patterns (24, 35). This issue is particularly important for accurate estimation of success rates of tuberculosis control programs and for evaluation of clinical trials of new therapies.

Extrapolation of the rates of IS6110 RFLP changes within serial isolates (3, 4, 18, 35, 36) has led to proposal of the use of IS6110 RFLP primarily as an inclusion tool for tracking ongoing transmission. Two strains with identical fingerprints are considered to be included in the same epidemiologically linked cluster (7, 36), while the status of strains differing by one or more bands remains undefined. In previous studies, IS6110 RFLP changes were observed in 4 to 29% of serial isolates (3, 4, 18, 35, 36) and in an estimated 18% of isolates within chains of transmission in a period covering 6.5 years (34). Exceptionally, no changes were observed in IS6110 RFLP patterns obtained from isolates collected sequentially from patients in Texas, but most of these organisms were obtained within 60 days of one another, which may be a period too short for variation to be observed (22). Therefore, if one considers only absolutely identical IS6110 RFLPs as the sole criterion for inclusion of isolates in the same cluster, a significant proportion of isolates would be erroneously excluded (36).

The results presented here support MIRU VNTR genotyping as an efficient alternative to IS6110 RFLP as an exclusion/inclusion method for tracking ongoing transmission. Based on the stability of the 12 MIRU VNTR loci observed here, less than 2% of the isolates could be extrapolated to be erroneously excluded from a cluster if one considered absolute identity of all 12 MIRU loci as the sole criterion. Given the advantages of MIRU VNTR genotyping with respect to speed and ease of analysis, reproducibility, and discriminatory power (16, 26), we suggest the use of MIRU VNTR typing as a first-line analysis to identify clusters during ongoing transmission. Optionally, this first-line analysis could be complemented by spoligotyping (9). This simple PCR-based method targets a single locus and has lower discriminatory power but can nevertheless help distinguish between some MIRU VNTR or other VNTR genotypes with no apparent epidemiological links (12, 16, 23, 25). In cases where MIRU VNTR (and possibly spoligotype) profiles are identical, IS6110 RFLP could be used as a second-line analysis to confirm potential epidemiological links between isolates. This two-step strategy would be expected to increase the accuracy of outbreak investigations and to considerably accelerate epidemiological studies of M. tuberculosis.


شاهد الفيديو: DNA Technology: DNA Profiling. A-level Biology. OCR, AQA, Edexcel (كانون الثاني 2022).